甲殼素及其衍生物的制備與抑菌活性研究

尹秀蓮，游慶紅，3，周興海

（1.淮陰工學院江蘇省生物質轉化與過程集成工程實驗室，江蘇淮安223001；2.南京大學淮安高新技術研究院，江蘇淮安223001；3.江蘇省生物質能與酶技術重點實驗室，江蘇淮安223300）

甲殼素及其衍生物的制備與抑菌活性研究

尹秀蓮1，2，游慶紅1，2，3，周興海1

（1.淮陰工學院江蘇省生物質轉化與過程集成工程實驗室，江蘇淮安223001；2.南京大學淮安高新技術研究院，江蘇淮安223001；3.江蘇省生物質能與酶技術重點實驗室，江蘇淮安223300）

對從龍蝦廢棄物制備的甲殼素、殼聚糖及其衍生物甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽對3種G-菌與3種G+菌的抗菌活性進行了研究。MIC試驗結果表明甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽對所有測試菌株的MIC均＜0.01%，比甲殼素、殼聚糖表現出更高的抑菌活性。通過繪制生長曲線，對4種物質的抑菌活性進行研究，結果表明0.1%的殼聚糖能抑制64%的枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌，說明桿菌屬對殼聚糖比較敏感，甲殼低聚糖對G+菌都表現出較強的抑菌作用，氨基葡萄糖鹽酸鹽能完全抑制金黃色葡萄球菌的生長。甲殼素和殼聚糖對G-大腸桿菌、綠膿假單胞菌有一定的抑制作用，對沙門氏菌基本沒有抑制作用。0.1%的甲殼低聚糖與氨基葡萄糖鹽酸鹽對幾種G-菌的抑制作用較強。甲殼素和殼聚糖可作為較有效的抑菌劑，甲殼低聚糖與氨基葡萄糖鹽酸鹽可作為幾種受試G-菌的殺菌劑。

甲殼素；殼聚糖；甲殼低聚糖；氨基葡萄糖鹽酸鹽；抑菌

甲殼素以高度有序的結晶微纖維形式廣泛存在于蝦殼、蟹殼、昆蟲外殼、真菌和藻類等細胞壁中，是地球上除蛋白質外含氮量最高的天然有機化合物[1]，殼聚糖是甲殼素經脫乙?；蟮漠a物，是一種天然高分子的多糖化合物，殼聚糖是目前研究得比較多的一種天然防腐保鮮劑，甲殼素和殼聚糖由于其分子結構中內外氫鍵的相互作用，形成了有序的大分子結構，相對分子質量通常在幾十萬至幾百萬，不溶于水等一般溶劑，應用受到極大限制。經過降解得到的低相對分子質量殼聚糖不僅溶解性好，而且具有某些獨特的性質[2-3]。D-氨基葡萄糖鹽酸鹽又稱葡萄糖胺鹽酸鹽，葡萄糖結構中C2-羥基被氨基取代，鹽酸與氨基成鹽，是甲殼素的一種重要衍生物[4]。

近年來，甲殼素、殼聚糖及其衍生物對不同的微生物例如細菌、酵母菌及真菌等的抑制作用引起學者們廣泛的重視，并對其抑菌機制進行了研究[5-6]。關于殼聚糖在食品防腐保鮮方面的應用的研究越來越多，但是在殼聚糖的抑菌機理和抑菌特性方面，不同的研究者得出的結論去不盡相同[7]。目前，雖然對甲殼素、殼聚糖及其衍生物的抑菌活性研究較多，但是大多都是對其中的單個成分的抑菌活性研究，系統研究較少。本實驗以龍蝦廢棄物為原料，制備甲殼素、殼聚糖及甲殼低聚糖，并對其抑菌活性進行系統研究比較，為甲殼素、殼聚糖及其衍生物在食品、飼料等工業領域的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

三株G+：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC6538）， 枯 草 芽 孢 桿 菌 （Bacillus subtilis，ATCC6633）， 蠟 樣 芽 孢 桿 菌 （Bacillus cereus，ATCC11778）；三株G-：大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC25922），綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC27853）， 沙 門 氏 菌 （Salmonella typhi，ATCC14028），購于ATCC菌種保藏中心。

1.1.2 主要材料與試劑

龍蝦殼：取自江蘇盱眙地產龍蝦；其余所用試劑均為國產分析純。

1.1.3 實驗儀器

QYC－211恒溫搖床：上海福馬實驗設備有限公司；BCM－1000超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；HH－6數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；UV－2401PC紫外分光光度計：日本島津。

1.2 方法

1.2.1 甲殼素及殼聚糖的制備

采用參考文獻[8]的方法，以龍蝦殼為原料，酸堿法處理后，得到甲殼素。甲殼素在NaOH溶液中回流脫乙酰基，得殼聚糖。

1.2.2 甲殼低聚糖的制備[9]

取殼聚糖按比1∶30（W/V）比例加入到2%乙酸溶液中，振搖，使其完全溶解呈均相狀態。在80℃條件下滴加濃度為3%的H2O2溶解的殼聚糖中1 h，邊滴邊攪拌，滴加完畢繼續反應2 h，H2O2量與殼聚糖乙酸溶液量比例為1∶5。用2 mol/l NaOH溶液將反應液pH調到10，濾液加3倍量乙醇（體積分數），放置過夜，抽濾，經30℃真空干燥得甲殼低聚糖。

1.2.3 氨基葡萄糖鹽酸鹽的制備[10]

稱取0.3 g殼聚糖，溶于100 mL 1%（體積分數）的醋酸溶液中，用攪拌使其充分溶解，按殼聚糖與鹽酸溶液1∶7的比例加入15%鹽酸水解3 h，過濾，得氨基葡萄糖鹽酸鹽粗品溶液。

取氨基葡萄糖鹽酸鹽溶液加入質量分數為95%的乙醇調節乙醇終濃度至75%，搖勻后靜止放置12 h后析出沉淀，過濾，得淡黃色氨基葡萄糖鹽酸鹽粗品。粗品用蒸餾水溶解，過濾，加丙酮重結晶3次。

將上述得到的結晶狀物用蒸餾水溶解，按質量濃度0.1%的比例加入活性炭，攪拌，然后抽濾，得到透明澄清的濾液，濾液濃縮后加入丙酮，沉淀過濾、干燥，得到白色晶體狀氨基葡萄糖鹽酸鹽。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）及抑菌活性的測定[11]

定量稱取無菌甲殼素、殼聚糖、甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽，溶于1%的醋酸溶液使成1%（w/v）的溶液，然后加入到MH瓊脂菌懸液中，使其最終濃度分別為0.1%、0.08%、0.05%、0.01%、0.005%、0.003%（w/v），然后于搖床37℃培養一定時間。于640 nm測定菌懸液濁度來確定抑菌效果，MIC定義為完全抑制細菌生長的最低濃度。陰性對照組為取1%的醋酸溶液加入到MH瓊脂菌懸液中，然后于搖床37℃培養。

以吸光度值為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制不同樣品的時間-吸光度曲線（生長曲線）。

1.2.5 殼聚糖脫乙酰度的測定

采用文獻[12]的方法，以甲基橙-苯胺藍為指示劑，用NaOH標準溶液滴定，根據NaOH的量即可算出樣品的脫乙酰度（DD）。

1.2.6 甲殼素與殼聚糖的黏均分子量的測定

采用黏度法[7]。甲殼素的溶劑采用二甲乙酰胺，殼聚糖的溶劑為用0.2 mol/L乙酸-0.3 mol/L乙酸鈉溶液，在30℃的恒溫水槽中進行。相對分子質量的計算用Mark-Houwink經驗公式：

式中：[η]為黏度，甲殼素常數K為1.81×10-3mL/g，α為0.93。

1.2.7 甲殼低聚糖分子量測定

以氨基葡萄糖為標準品，以DNS試劑為反應試劑，于520 nm處測定吸光度值，按文獻[13]方法計算甲殼低聚糖分子量。

2 結果與分析

2.1 所得樣品性質

試驗中所得的甲殼素的經測定黏均分子量為41× 104U，脫乙酰度為32%。殼聚糖的黏均分子量5×104U，脫乙酰度為75%。甲殼低聚糖均分子量為2 100 U。

2.2 最低抑菌濃度（MIC）的測定

甲殼素、殼聚糖、甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽的最低抑菌濃度見表1。

表1 最低抑菌濃度（MIC）Table 1 Minimum inhibitory concentration（MIC）%

甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽對測試菌種的MIC比甲殼素、殼聚糖要低。甲殼素、殼聚糖對不同的菌株的MIC有著較大的差異，對綠膿假單胞菌、沙門氏菌的MIC大于等于0.1%，甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽對所有測試菌株的MIC均較小，說明甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽對所測試菌株比甲殼素、殼聚糖表現出更高的抑菌活性。

4種抑菌物對G-菌的MIC值統計分析表明，甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽的抑菌性能與甲殼素、殼聚糖的抑菌性能具有極顯著差異（p＜0.01），對G+中的金黃色葡萄球菌具有極顯著差異（p＜0.01），但是對枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌，4種抑菌物都表現出了一定的抑菌性能，彼此不存在顯著性差異。

2.3 各樣品的抑菌效果

2.3.1 對G+的抑制效果

0.1%（w/v）的甲殼素、殼聚糖、甲殼低聚糖及氨基葡萄糖鹽酸鹽對幾種G+菌的抑菌特性見圖1、圖2、圖3。

圖1 金黃色葡萄球菌Fig.1 Staphylococcus aureus

圖2 蠟樣芽孢桿菌Fig.2 Bacillus cereus.Frankland

圖3 枯草芽孢桿菌Fig.3 Bacillus subtilis

橫坐標為菌種培養時間，縱坐標為640 nm處吸光度，吸光度值越小表明抑菌效果越好。

從圖1中可以看出，陰性對照組中金黃色葡萄球菌生長很迅速，在培養5 h后達到穩定期，其吸光度為0.54。加入樣品的實驗菌株生長緩慢，含有0.1%的甲殼素和0.1%的殼聚糖的兩組實驗在8 h達到穩定生長期，吸光度值分別為0.40、0.37，說明甲殼素與殼聚糖對金黃色葡萄球菌的生長有一定的抑制作用。甲殼低聚糖及氨基葡萄糖鹽酸鹽表現出相對較強的抑制活性，甲殼低聚糖組在3 h達到最大吸光度值，且吸光度值僅為0.18，氨基葡萄糖鹽酸鹽組先有一定的生長，到2 h時，吸光度值降低，然后趨于0，說明該組的實驗菌株的生長完全被抑制。

由圖2、圖3可以看出，0.1%的殼聚糖能抑制64%的枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌，說明桿菌屬對殼聚糖比較敏感，與文獻[13]報道的一致。甲殼素、甲殼低聚糖及氨基葡萄糖鹽酸鹽對桿菌屬也有一定的抑制作用。

2.3.2 對G-的抑制效果

0.1%（w/v）的甲殼素、殼聚糖、甲殼低聚糖及氨基葡萄糖鹽酸鹽的對幾種G-菌的抑菌特性見圖4、圖5、圖6。

圖4 大腸桿菌Fig.4 Escherichia coli

圖5 沙門氏菌Fig.5 Salmonella

圖6 綠膿假單胞菌Fig.6 Pesudomonas pyocyaneum

陰性對照組的細菌數量隨著時間的增加而迅速增加，培養4 h后就達到了穩定期。甲殼素與殼聚糖對大腸桿菌有一定的抑制作用，約在4 h后達到穩定期，最大吸光度值為0.3、0.24，甲殼素和殼聚糖對大腸桿菌的抑制25%，對綠膿假單胞菌的抑制作用較弱，由圖5可以看出，甲殼素組、殼聚糖組與對照組的曲線基本重合，說明甲殼素、殼聚糖對沙門氏菌基本沒有抑制作用。0.1%的甲殼低聚糖與氨基葡萄糖鹽酸鹽對幾種G-菌的抑制作用較強，4 h后吸光度值迅速降近0，甲殼低聚糖與氨基葡萄糖鹽酸鹽的抑菌活性比甲殼素和殼聚糖高，氨基葡萄糖鹽酸鹽為較有效的抑菌劑。

由結果可以看出，甲殼素與殼聚糖對大部分試驗菌都有一定的抑制作用，但是，不能完全抑制試驗菌的生長，存活的細菌會繼續繁殖。殼聚糖的抗菌活性強于甲殼素，尤其是對G-菌，可能是由于殼聚糖有許多陽離子胺基可以與細菌細胞表面的多糖、脂類及蛋白質的陰離子基團結合從而抑制微生物的生長。其抑菌機理可能為其會導致菌體絮凝然后使其因為缺少營養及氧氣從而使細菌死亡。然而，在本實驗濃度下，殼聚糖與甲殼素不能把所有的細菌都殺滅，另外，如果殼聚糖的分子量小，其聚合鍵可以與多個細胞結合。由此，細菌細胞與殼聚糖聚合物鏈橋可以很容易的建立，從而使細菌迅速滅活。甲殼低聚糖與氨基葡萄糖鹽酸鹽可作為殺菌劑[13]。低聚糖可能能透過細菌的細胞壁，殼聚糖對細菌的抑制作用跟劑量有關。

3 結論

1）甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽對所有測試菌株的MIC均較小，說明甲殼低聚糖、氨基葡萄糖鹽酸鹽對所測試菌株比甲殼素、殼聚糖表現出更高的抑菌活性。

2）甲殼素、殼聚糖對G+菌都表現出一定的抑菌性能，0.1%的殼聚糖能抑制64%的枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌，說明桿菌屬對殼聚糖比較敏感，甲殼低聚糖對G+菌都表現出較強的抑菌作用，氨基葡萄糖鹽酸鹽能完全抑制金黃色葡萄球菌的生長。

3）甲殼素和殼聚糖對大腸桿菌、綠膿假單胞菌有一定的抑制作用，對沙門氏菌基本沒有抑制作用。0.1%的甲殼低聚糖與氨基葡萄糖鹽酸鹽對幾種G-菌的抑制作用較強，氨基葡萄糖鹽酸鹽為較有效的抑菌劑。

4）甲殼素和殼聚糖可作為較有效的抑菌劑，甲殼低聚糖與氨基葡萄糖鹽酸鹽可作為幾種受試G-菌的殺菌劑。

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Preparation and Antibacterial Activity of Chitin and Its Derivatives

YIN Xiu-lian1，2，YOU Qing-hong1，2，3，ZHOU Xing-hai1
（1.Jiangsu Provincial Engineering Laboratory for Biomass Conversion and Process Integration；Huaiyin Institute of Technology，Huaian 223001，Jiangsu，China；2.Huaian High-Tech Research Institute of Nanjing University，Huaian 223001，Jiangsu，China；3.Jiangsu Key Laboratory for Biomass-based Energy and Enzyme Technology，Huaian 223300，Jiangsu，China）

The antimicrobial activities of chitin，chitosan isolated from shrimp shell waste and their derivate chito-oligosaccharides，glucosamine hydrochlorid against three Gram-positive and three Gram-negative bacteria were studied.Results of MIC experiments showed that the MIC of chito-oligosaccharides and glucosamine hydrochlorid were all＜0.01%，their antimicrobial activities were higher than that of chitin and chitosan.Through growth curve，the antimicrobial activities were studied.Results showed that chitosan of 0.1%could inhibit 64% Bacillus subtilis and Bacillus cereus，which demonstrated that Bacillus are more sensitive to chitosan.Chitooligosaccharides showed strong antimicrobial activities to all Gram-positive bacteria.Gucosamine hydrochlorid could inhibit the growth of Staphylococcus aureus completely.Chitin and chitosan showed some inhibit activity on Gram-negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa，but have no effect on Salmonella typhi. chito-oligosaccharides and glucosamine hydrochlorid of 0.1%had strong inhibit effect on all three Gramnegative bacteria.Chitin and chitosan can be used as effective bacterial inhibitor，chito-oligosaccharides and glucosamine hydrochlorid can be used as bacteriocide of the three Gram-negative bacteria used in the experiments.

chitin；chitosan；chito-oligosaccharides；glucosamine hydrochlorid；antimicrobial activities

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.19.004

2013-05-30

江蘇省科技廳資助項目（No.BN2011008）；江蘇省教育廳資助項目（No.12KJB480003）；江蘇省生物質能與酶技術重點實驗室開放課題（No.JSBEET1203）

尹秀蓮（1978—），女（漢），副教授，碩士，研究方向：天然活性成分分離及應用。