PKM2在胃癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征之間的關(guān)系

劉妍芳，張 謙，韓振魁，斯坎德?tīng)?，羅蘇明

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科，新疆 烏魯木齊 830001)

PKM2在胃癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征之間的關(guān)系

劉妍芳，張 謙，韓振魁，斯坎德?tīng)?，羅蘇明

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科，新疆 烏魯木齊 830001)

目的 探討PKM2在人胃腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)67例胃腺癌組織、53例癌旁組織中PKM2蛋白的表達(dá)及其與臨床病例參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果 PKM2蛋白在胃腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)(67.2%，45/67)明顯高于癌旁組織中PKM2蛋白的表達(dá)(28.3%，15/53)，PKM2蛋白在胃腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)與患者的性別、年齡、分化程度均無(wú)關(guān)(P＞0.05)，而與患者的淋巴結(jié)(χ2=12.103，P=0.001)是否轉(zhuǎn)移與腫瘤侵潤(rùn)深度(χ2=4.030，P=0.045)密切相關(guān)。結(jié)論 PKM2蛋白在胃腺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)明顯高于癌旁組織，且其陽(yáng)性表達(dá)與患者淋巴結(jié)與否、腫瘤侵犯深度密切相關(guān)，有望成為胃腺癌診斷與治療的靶向標(biāo)志物。

胃腺癌；PKM2；免疫組織化學(xué)

1.2 方法與試劑 所有120例標(biāo)本均經(jīng)過(guò)4%的多聚甲醛固定后，進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)制備4 μm厚度連續(xù)切片，并使用免疫組化SP法嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。二甲苯脫蠟，檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，10%正常羊血清室溫孵育，兔抗人單克隆抗體PKM2孵育4°過(guò)夜(抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology，抗體的使用濃度為1：200)，進(jìn)而常溫二抗孵育，DAB顯色等步驟。使用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。SP試劑盒與二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑均購(gòu)自中山金橋生物有限公司。

1.3 結(jié)果判定 采用半定量積分方法[7]，每張切片選擇5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)不少于1 000個(gè)細(xì)胞，依據(jù)視野下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，＞75%為4分。依據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：細(xì)胞未著色或呈淡黃色為0分，棕黃色為1分，棕褐色為2分。采用將顯色深淺與顯色范圍評(píng)分相乘的方法進(jìn)行綜合評(píng)分，而為便于統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)一將0～3分為陰性，4～8分為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PKM2在胃腺癌組織中的表達(dá)情況 PKM2在67例胃腺癌組織中有45例為陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為67.2%(45/67，圖1)，且主要定位在胞質(zhì)中，而53例癌旁組織中僅有15例陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率為28.3%(15/53)，明顯低于PKM2在胃腺癌組織中的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 PKM2在胃腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

2.2 PKM2在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 PKM2蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與性別、年齡、分化程度均無(wú)關(guān)(P＞0.05)，而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PKM2蛋白的表達(dá)率明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(χ2=12.103，P=0.001)，腫瘤侵潤(rùn)深度T3+T4組PKM2蛋白表達(dá)明顯高于T1+T2組中PKM2的表達(dá)率(χ2=4.030，P=0.045)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

臨床病理因素 分類PKM2χ2值P值年齡(歲)≥60＜60 0.3690.544性別陰性13 9 150.2280.633淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否7 7 1 12.1030.001分化程度男女是否G 1 0.1950.097腫瘤侵潤(rùn)深度5 6 9 7 1 4.0300.045大小(cm) G2 G3 T1+T2 T3+T4＞5≤5陽(yáng)性30 15 28 17 35 10 13 20 12 15 30 26 19 3 9 1 2 100.0630.802

圖1 PKM2在人胃腺癌組織與癌旁組織中的表達(dá)

3 討論

丙酮酸激酶是糖酵解途徑的一個(gè)關(guān)鍵酶，其具有四種同工酶(L-PK、R-PK、M1-PK、M2-PK)，而這四種同工酶通常以酶的活性四聚體形式存在，其分布亦有一定的組織特異性。M2-PK主要分布于腸、肺以及增殖或未分化的組織中，新近的研究逐漸發(fā)現(xiàn)在人類多種惡性腫瘤中亦有PKM2的異常表達(dá)，在惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中具有重要的作用。二十世紀(jì)50年代，諾貝爾獎(jiǎng)得主奧托·瓦伯格提出所謂的“Warburg效應(yīng)，”即由于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度過(guò)快，明顯高于正常組織，使得腫瘤細(xì)胞經(jīng)常處于一種缺氧狀態(tài)，為適應(yīng)這種狀態(tài)，癌細(xì)胞關(guān)閉線粒體的有氧氧化，從而基本依賴糖酵解供能[8]。隨著對(duì)惡性腫瘤代謝機(jī)制的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)存在于惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)的PKM2可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞“Warburg效應(yīng)”的發(fā)生，并對(duì)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。PKM2的存在形式以活躍的四聚體和活性低的二聚體為主，而兩者之間的轉(zhuǎn)化速度主要由糖酵解磷酸化代謝果糖-1，6-二磷酸鹽(Fructose-1，6-Diphosphate，F(xiàn)DP)控制，生理情況下，F(xiàn)DP水平和PKM2活性極低，而在腫瘤細(xì)胞中，F(xiàn)DP水平上調(diào)并PKM2的活性增加，使得低活性的二聚體向高活性的四聚體轉(zhuǎn)變的速度加快，從而促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞中糖酵解的速度[9-10]。

隨著研究的深入，PKM2在人類多種惡性腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)，包括目前發(fā)現(xiàn)的在大腸癌患者的糞便樣品中，肺癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌、卵巢癌血漿中以及胸部惡性腫瘤患者的胸腔積液中都可檢測(cè)到PKM2蛋白的存在，肝癌、大腸癌腫瘤組織中PKM2的表達(dá)亦增高，且其含量與腫瘤的分期密切相關(guān)[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)PKM2在人胃腺癌組織中的表達(dá)率(67.2%，45/67)明顯高于其癌旁組織(28.3%，15/53)，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PKM2蛋白的表達(dá)可能與胃腺癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)，與之前的研究結(jié)果[12]基本一致。Christofk等[13]的研究結(jié)果顯示PKM2的高表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的糖酵解的異常激活，通過(guò)使用shRNA技術(shù)敲除人肺癌細(xì)胞株H1299 PKM2基因后，致瘤性明顯降低。在PKM2蛋白表達(dá)與腫瘤臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系分析中顯示高表達(dá)的PKM2蛋白與腫瘤患者的性別、年齡以及腫瘤的組織學(xué)分化程度均無(wú)關(guān)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否以及腫瘤侵犯深度有關(guān)，提示PKM2蛋白的表達(dá)可能參與到胃腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程中。譚麗等[14]的研究提示使用siRNA敲除BGC-823細(xì)胞PKM2后，與對(duì)照組相比BGC-823細(xì)胞所表現(xiàn)的腫瘤遷移作用明顯下降。這可能是由于PKM2蛋白被下調(diào)后，糖代謝發(fā)生異常，使得ATP能量供應(yīng)嚴(yán)重缺乏，最終影響細(xì)胞的增殖與遷移等生物學(xué)行為。

綜上所述，人胃腺癌組織中PKM2的表達(dá)明顯高于其癌旁組織，且與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否，腫瘤侵犯深度密切相關(guān)，提示PKM2在胃腺癌的進(jìn)展與遷移中可能發(fā)揮著重要的作用，但其在胃腺癌組織中的具體機(jī)制，還有待我們進(jìn)一步探討，以期為胃腺癌的早期診斷與靶向治療提供一個(gè)新的方向。

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Expression and clinical significance of PKM2 in human gastric adenocarcinoma.

LIU Yan-fang,ZHANG Qian, HAN Zhen-kui,Sikandeer,LUO Su-ming.
Department of Gastrointestinal Surgery，the People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous,Urumqi 830001,Xinjiang,CHINA

Objective To investigate the immunohistochemical expression and diagnostic significance of PKM2 in human gastric adenocarcinoma.MethodsImmunohistochemical study was carried out to examine the expression of PKM2 and its association with clinicopathologic features in human gastric adenocarcinoma.ResultsThe positive rate for PKM2 expression in gastric adenocarcinoma tissues(67.2%,45/67)was significantly higher than that in non-tumor tissues(28.3%,15/53);the positive expression of PKM2 was not correlated with the patient's gender,age and histologic differentiation(P＞0.05)except lymph node metastasis(χ2=12.103,P=0.001)and tumor invasion(χ2= 4.030,P=0.045).ConclusionPKM2 prefers stainning for gastric adenocarcinoma to for non-tumor tissues,and the positive expression was correlated with lymph node metastasis and tumor invasion.

Gastric adenocarcinoma;PKM2;Immunohistochemisty

R735.2

A

1003—6350（2014）02—0161—03

1 材料與方法

韓振魁。E-mail：qwertyu1213123@126.com

2013-07-22)

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.02.0062

胃癌（Gastric cancer，GC）是全球第四常見(jiàn)惡性腫瘤，在所有腫瘤致死率中排名名第二[1]，就我國(guó)而言，其發(fā)病率和死亡率均居各類腫瘤首位。由于其發(fā)病的隱匿性，使得胃癌常常在確診時(shí)已處于進(jìn)展期(Ⅲ期或Ⅳ期)，預(yù)后較差[2]。目前為止，針對(duì)胃癌有效的分子靶向治療仍然較少[3]。因此，尋找胃癌新的分子標(biāo)志物，提高胃癌早期確診率，以及尋找胃癌治療的新的靶點(diǎn)顯得尤為重要。M2型丙酮酸激酶(M2 isoform of pyruvate kinase，PKM2)為細(xì)胞糖酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其在三磷酸核苷的合成過(guò)程中起決定性作用[4]。近年發(fā)現(xiàn)其在包括肺癌、乳腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞或組織中呈過(guò)表達(dá)，在腫瘤的代謝過(guò)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用[5-6]，但PKM2在胃腺癌組織中的表達(dá)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用免疫組化SP法檢測(cè)67例胃腺癌組織，53例癌旁組織中PKM2的表達(dá)情況，并初步探討其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，為下一步實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

1.1 一般資料 收集我院2008年1月至2013年1月期間外科手術(shù)切除的120例石蠟標(biāo)本，其中包括胃腺癌組織67例，均經(jīng)HE染色確診為胃腺癌；以及取同一標(biāo)本距癌組織邊緣3 cm以上的胃組織，均經(jīng)HE染色證實(shí)無(wú)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)明顯細(xì)胞增生等病變的癌旁組織53例。所有的病例術(shù)前均無(wú)化療、放療及免疫治療史。67例胃腺癌組織中男性標(biāo)本43例，女性24例，年齡47～73歲，中位年齡63歲；高分化19例，中分化29例，低分化19例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例。腫瘤浸潤(rùn)深度：按照國(guó)際TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，局限于黏膜或黏膜下層的早期胃癌定為T1，侵及胃壁肌層，但大小不超過(guò)一個(gè)分區(qū)的1/2的為T2，腫瘤侵及胃壁漿膜層，或雖未侵及漿膜層，但病變已大于一個(gè)分區(qū)的1/2，但未超出一個(gè)分區(qū)定為T3，腫瘤占一個(gè)分區(qū)以上或已累及周圍臟器定為T4，其中T1+ T2組28例，T3+T4組39例。