細(xì)菌基因組DNA提取方法簡化的研究

馮唐鍇 趙文亮

(景德鎮(zhèn)學(xué)院生物與化學(xué)工程系，江西 景德鎮(zhèn) 333000)

DNA提取是生物學(xué)領(lǐng)域最基礎(chǔ)的操作，是科研和生產(chǎn)中常用的方法。目前DNA提取分離的常見方法，一般是用CTAB、SDS等緩沖液裂解細(xì)胞，而后通過酚氯仿抽提蛋白質(zhì)，再用乙醇沉淀的方法來抽提DNA。該過程干擾因素多、工藝繁瑣。目前廣泛認(rèn)為核酸提取過程中低溫是必備條件，通常用液氮冷卻。但是液氮并非所有地區(qū)都能夠生產(chǎn)，運(yùn)輸也很麻煩。如能利用化學(xué)試劑替代液氮的作用，并進(jìn)一步簡化核酸提取方法，對(duì)促進(jìn)生物基因資源的利用有著重大的意義。本文正是基于這一考慮，探索和研究了細(xì)菌DNA提取中盡可能簡化的方式。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

菌種:大腸桿菌tg1。培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基。電泳介質(zhì):1%瓊脂糖凝膠。

1.2 兩個(gè)菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)和保存

大腸桿菌tg1的擴(kuò)大培養(yǎng)和保存。無菌條件下將0.2ml大腸桿菌tg1菌液接種至200ml。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中。36℃恒溫振蕩培養(yǎng)36h。取培養(yǎng)的菌體懸浮液在平板培養(yǎng)基上劃線恒溫培養(yǎng)36h。在平板上挑取分離純化的菌落接種在1000ml液體培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)36h后，部分菌液按照菌液:甘油=3:7的比例，制成0.5ml的甘油保種菌液。

1.3 改良CTAB法提取細(xì)菌基因組DNA

收集大腸桿菌Tg1菌體沉淀，懸浮于1ml TE溶液(PH8.0)，先后加入10%SDS溶液0.5ml、5mol/LNaCl溶液0.15ml、CTAB/NaCl溶液0.15ml，混勻，65℃保溫20min。5000rpm離心10min，上清液分裝至1.5ml離心管，0.5ml每管。等體積的酚:氯仿:異戊醇(25∶24∶1)。

抽提，5000rpm離心10min，取上清。加1倍體積異丙醇顛倒混勻，4℃靜置2h，10000rpm離心15min得DNA沉淀。70%乙醇漂洗DNA沉淀后，將沉淀溶解于TE溶液中，-20℃保存。

1.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA

取TAE電泳工作緩沖液100ml加入1g瓊脂糖在微波爐中加熱至沸騰，振蕩溶解后搖勻。溶膠倒入膠槽，加入膠槽配套梳子，冷卻成凝膠后，拔出梳子，將膠槽置于裝滿TAE電泳工作緩沖液的電泳槽中進(jìn)行電泳。取1μl DNA樣品與0.2μl濃度為1%的溴酚藍(lán)指示液混勻，用移液槍點(diǎn)加入點(diǎn)樣孔中。點(diǎn)樣孔在負(fù)極一端，穩(wěn)定電壓120V，電流50mA開始電泳，直至溴酚藍(lán)指示液到達(dá)凝膠的2/3處為止。電泳完畢后將凝膠移入低濃度EB溶液中染色30min，在凝膠成像系統(tǒng)中選擇波長254nm的紫外燈下照射并觀察染色后的凝膠。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

大腸桿菌培養(yǎng)得到1000ml液體菌液，用1.5ml離心管分裝20支0.5ml的甘油保種菌液，冷藏備用。其余菌液用于DNA提取，提取結(jié)果能夠明顯觀察到白色沉淀。瓊脂糖凝膠電泳染色后，在凝膠成像系統(tǒng)中能觀察到明顯的基因組DNA條帶，如圖1所示。

2.2 討論

細(xì)菌DNA提取是生物學(xué)領(lǐng)域一種常見的操作。本文的方法在DNA提取常用方法［1］基礎(chǔ)上做了簡化。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌細(xì)胞破壁時(shí)間不夠，會(huì)嚴(yán)重影響產(chǎn)物的生成。使用菌液不足也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。一倍體積異丙醇沉淀DNA的操作如改用2倍體積的乙醇，效果要略差一些，但是或可進(jìn)一步調(diào)整乙醇用量。用異戊醇替代異丙醇時(shí)，DNA得率較差。DNA靜置沉淀時(shí)間一般要求為12h，但是如果菌液使用量較大，則縮短至2h也可得到理想結(jié)果。省略NaAc溶液漂洗DNA沉淀的過程，對(duì)DNA粗提取影響不大。

3 展望

本文中的提取方法相對(duì)傳統(tǒng)方法而言進(jìn)行了簡化，但是簡化得還不夠徹底，各步驟之間的整合集成程度還不夠。植物、動(dòng)物樣品的DNA提取過程中，還要考慮到許多其他因素，如次生代謝產(chǎn)物和蛋白質(zhì)等對(duì)DNA提取的影響，其DNA的提取該如何簡化還有待進(jìn)一步研究。有文獻(xiàn)提到可用玻璃珠法提取DNA，景德鎮(zhèn)的陶瓷材料產(chǎn)業(yè)和科研十分發(fā)達(dá)，今后或可考慮利用一些特種陶瓷材料代替玻璃珠，來輔助核酸的提取純化。核酸提取方法的簡化，為分子生物學(xué)一般方法的推廣提供了前提條件，對(duì)生物技術(shù)的應(yīng)用和普及具有重要意義。

［1］宮強(qiáng)，關(guān)道明，王耀兵等.大腸桿菌總DNA快速提取方法的比較研究［J］.海洋環(huán)境科學(xué)，2005，24(4):63-66.