一種高質量天門冬基因組DNA提取方法

韋榮昌+韋樹根（等）

摘要：針對天門冬[Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.]成熟葉片富含多糖、多酚、蛋白質及其他次生代謝物質的特點，采用改良CTAB法對其基因組總DNA進行提取，并對DNA進行質量檢測。結果表明，改良CTAB法可從天門冬成熟葉片中獲得純度高、完整性好的總DNA，其OD260 nm/OD280 nm為1.86，OD260 nm/OD230 nm為2.36，濃度為390 μg/mL，產率達11.7 μg/g，多糖、多酚和RNA雜質被去除干凈，無降解現象，說明該方法提取的天門冬基因組總DNA質量較高。

關鍵詞：天門冬[Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.]；DNA提取；CTAB法

中圖分類號：R282；Q7 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1678-03

A Method for Extracting High Quality DNA from Mature Leaves

of Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.

WEI Rong-chang1，2，WEI Shu-gen1，FU Jin-e1，KE Fang1，PAN Li-mei1，DONG Qing-song1，TANG Qi3

（1. Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning 530023，China；

2. Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100193，China；3.Horticulture & Landscape College，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

Abstract：The mature leaves of Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr. are rich in polysaccharides， polyphenols， protein and other secondary metabolism compounds preventing DNA extraction. The genomic DNA of A. cochinchinensis （Lour.） Merr. was extracted by improved CTAB method and DNA quantity was checked. The results showed that the genomic DNA was pure and integral without polysaccharides， polyphenols， RNA and degradation. The value of OD260 nm/OD280 nm and OD260 nm/OD230 nm were 1.86 and 2.36， respectively. The concentration and yield of DNA was 390 μg/mL and 11.7 μg/g. It can be concluded that this method could be used for extracting DNA with high quality from A. cochinchinensis （Lour.） Merr.

Key words： Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.； DNA extraction； CTAB method

天門冬[Asparagus cochinchinensis （Lour.） Merr.]為百合科（Liliaceae）天門冬屬（Asparagus Linn.）多年生攀援草本植物，又名天冬，以干燥塊根入藥。性寒，味甘、苦，含有甾體皂苷、多糖、氨基酸等多種活性成分，具有養陰潤燥、清肺生津等功效[1]。目前，國內外對天門冬的研究主要集中在形態特征與生境習性[2]、藥材鑒別[3]、化學成分[4，5]、藥理與功效[6]、栽培技術[7，8]等方面，對其分子水平上的研究剛起步[9，10]，試驗材料也僅限于幼嫩葉片，而天門冬成熟葉片富含多糖、多酚、蛋白質和其他次生代謝物質，大大增加了DNA提取的難度。本研究對傳統CTAB法進行改良，獲得了一種得率高、穩定性好、實用性廣的天門冬成熟葉片基因組DNA提取方法，為開展天門冬分子生物學研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

天門冬新鮮葉片采自廣西藥用植物園科研基地，經中國醫學科學院藥用植物研究所馬小軍研究員鑒定。對種質資源圃中保存的17份天門冬種質資源進行收集，分別為百色野生大天冬、龍勝野生小天冬、陽朔栽培天冬、恭城野生小天冬、恭城野生大天冬、凌云野生大天冬、凌云野生小天冬、靈山野生小天冬、寧明野生小天冬、金秀野生小天冬、融水野生小天冬、靖西野生小天冬、靖西野生大天冬、田林野生大天冬、玉林野生大天冬、玉林野生小天冬、環江野生羊齒天門冬。每份種質選取生長狀況良好的植株，采集30片健康成熟的葉片，用硅膠干燥保存，帶回實驗室中待用。

1.2 儀器與試劑

低溫冰箱；高壓滅菌鍋；電子天平；水浴鍋；微量移液器；微型高速離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；電泳槽和電泳儀（北京市六一儀器廠）；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；凝膠成像系統（美國Un-verbindlicher Verkaufspreis）。β-巰基乙醇；氯仿/異戊醇（24∶1）；3 mol/L NaAC（pH 5.2）；異丙醇；75%乙醇；無水乙醇；2×CTAB抽提液[100 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），1.4 mol/L NaCl，20 mmol/L EDTA（pH 8.0），2%CTAB，1%PVP]；0.1 TE（pH 8.0）緩沖液[1.0 mmol/L Tris-Cl，0.1 mmol/L EDTA]。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA的提取

1）稱取成熟葉片（去主脈）1.0～2.0 g，置于研缽中，迅速用液氮將葉片組織研磨成細粉末狀，然后將粉末適量分裝于1.5 mL離心管中。

2 ）在各離心管中加入65 ℃預熱的2×CTAB抽提液1 000 μL和β-巰基乙醇20 μL，輕彈混勻，使粉末充分濕潤，置于65 ℃水浴鍋中溫浴15 min，其間上下倒置混勻數次。

3）12 000 r/min離心10 min，將上清液移至新的1.5 mL離心管中，棄沉淀。

4）在上清液中加入等體積的氯仿/異戊醇（24∶1），輕輕顛倒混勻，12 000 r/min離心10 min，將離心后所得上清液轉移入另一新的1.5 mL離心管中。重復抽提1次。

5）在上清液中先后加入1/10體積的3 mol/L NaAC（pH 5.2）和等體積異丙醇（NaAC和異丙醇均需提前預冷），輕輕翻轉混勻，白色絮狀沉淀出現后，放置于-20 ℃冰箱中冰浴1 h，沉淀DNA。

6 ） 12 000 r/min離心10 min，棄上清液，分別用75%乙醇、無水乙醇各洗滌沉淀1 次，倒扣于干凈濾紙上自然風干5～10 min，視沉淀量的多少加入20～50 μL的0.1 TE（pH 8.0）緩沖液溶解，置于-20 ℃貯存。

1.3.2 DNA質量檢測

1）DNA純度及產率測定：取5 μL DNA樣品，經TE稀釋100倍后，用紫外分光光度計檢測其在230、260、280 nm波長處的光吸收值。DNA的純度用OD260 nm/OD230 nm和OD260 nm/OD280 nm來表示，當OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0，OD260 nm/OD230 nm>2.0時，DNA的純度較高。若OD260 nm/OD280 nm<1.8時，說明DNA樣品中有蛋白質污染；若OD260 nm/OD280 nm>2.0時，說明有RNA污染；而當OD260 nm/OD230 nm<2.0時，則表明DNA溶液中有鹽和小分子雜質殘留。根據OD260nm=1.0時溶液濃度為50 μg/mL計算DNA質量濃度和產率：

DNA質量濃度（μg/mL）=OD260 nm×50 μg/mL×稀釋倍數

DNA產率（μg/g）=[DNA質量濃度（μg/mL）×TE體積（mL）]/試驗材料用量（g）

2）DNA分子完整性測定：取3 μL DNA溶液樣品，加適量溴酚藍染色，于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳（電壓≤5 V/cm）1 h，電泳緩沖液為1×TAE，電泳50～60 min后，經0.5 μg/mL溴化乙錠（EB）染色20～30 min，在凝膠成像系統上觀察照相、記錄。

3）SCoT-PCR擴增反應：用改良CTAB法制備的DNA作為模板，選用48號引物，其序列為5′-ACAATGGCTACCACTGGC-3′，進行SCoT-PCR擴增。25 μL反應體系中含10×Buffer 2.5 μL（10 mmol/L），Mg2+1.5 μL（1.5 mmol/L），dNTPs 0.5 μL（4.0 mmol/L），引物0.25 μL（10 μmol/L），Taq DNA聚合酶0.3 μL（5 U/μL），模板DNA 1 μL（50 μg/mL）。反應程序為：95 ℃預變性4 min，36個循環（95 ℃變性50 s，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min），72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。反應結束后取10 μL擴增產物置于瓊脂糖凝膠中電泳，以Lambda DNA/EcoRⅠ+Hind Ⅲ Marker為標準分子量對照，EB染色后進行紫外光檢測。

2 結果與分析

2.1 天門冬DNA純度及產率

經紫外分光光度計檢測，天門冬DNA樣品的OD260 nm/OD280 nm=1.86（0.078/0.042），OD260 nm/OD230 nm=2.36（0.078/0.033）， 說明改良CTAB法提取的天門冬DNA純度較高，沒有多糖、多酚、蛋白質、RNA、鹽和小分子雜質污染。計算得到DNA質量濃度為390 μg/mL，DNA產率為11.7 μg/g。

2.2 天門冬DNA分子完整性

將天門冬DNA樣品進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果發現，改良CTAB法提取的天門冬DNA電泳條帶明亮、清晰，無拖尾、彌散現象，說明該方法提取的天門冬DNA分子完整性較好，無降解現象。圖1為天門冬總DNA電泳圖。

2.3 天門冬DNA SCoT-PCR擴增結果

用改良后的CTAB法提取的天門冬DNA作為模板進行SCoT-PCR擴增。取PCR擴增產物10 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖2所示，所得SCoT-PCR擴增條帶清晰，帶型豐富，無雜帶，可以用于天門冬種質資源遺傳多樣性分析。

3 小結與討論

高質量基因組DNA的提取是進行分子標記等分子生物學研究的基礎[11]，天門冬成熟葉片富含多糖、多酚、蛋白質和次生代謝物質等，在DNA提取過程中，此類物質可與DNA共沉淀、形成膠狀難溶物或產生褐變，嚴重影響DNA的質量[12，13]。而幼嫩新生組織中的多糖、多酚和次生代謝物質較少，細胞易于破碎，DNA提取產率高。因此，應選擇幼嫩、代謝旺盛的新生組織作為提取DNA的材料[14]。

通過一系列措施，有效控制了天門冬成熟葉片中多糖、多酚、蛋白質和次生代謝物質等對DNA提取的影響。首先，CTAB既能有效裂解植物的細胞壁，又能溶解細胞膜，可較好地去除多糖等雜質；其次，高分子合成樹脂PVP作為一種酚的絡合物，同時含有親水基團和親油基團，易溶于極性的有機溶劑，可有效地去除酚類物質[15]；而β-巰基乙醇的巰基能與酚類物質競爭氧，從而避免其氧化成醌類[16]，但PVP和β-巰基乙醇單獨使用效果不好，只有將二者按一定比例配合使用效果才理想。

改良CTAB法提取植物基因組DNA過程中，通過氯仿-異戊醇抽提，除去蛋白質等雜質，試驗發現，抽提1次，尚有雜質殘留，抽提3次，DNA產率降低，而抽提2次的DNA質量較高，這與陸嘉惠等[17]的報道基本一致。

植物基因組DNA提取方法較多，但其原理基本相同，主要包括破碎細胞、裂解細胞或組織，以去詬劑溶解細胞膜，從而促使蛋白質變性，再用氯仿-異戊醇等有機溶劑對DNA進行抽提純化。由于核酸基本集中在細胞內，所以研磨的質量好壞是提取基因組DNA的關鍵，只有充分研磨，細胞才能破碎，核酸才得以釋放[18]。

本試驗是在CTAB法的基礎上進行改良的，以傳統的CTAB法為對照，但是由于成熟葉片富含多糖、多酚、蛋白質和其他次生代謝物質，傳統的CTAB法無法提取天門冬的DNA，電泳結果為空白，故本試驗只對改良CTAB法進行分析和PCR擴增驗證。

參考文獻：

[1] 中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學工業出版社，2010.

[2] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志（第十五卷）[M].北京：科學出版社，1978.106-108.

[3] 王海萍，陳雪芬.中藥材天門冬的鑒別及其臨床應用[J].中藥現代藥物應用，2008，2（8）：39-40.

[4] 李志孝，黃成鋼，蔡育軍，等.天門冬多糖的化學結構及體外抗氧化活性[J].藥學學報，2000，35（5）：358-362.

[5] 徐從立，陳海生，譚興起，等.中藥天冬的化學成分研究[J].天然產物研究與開發，2005，17（2）：128-130.

[6] 熊大勝，許云香，郭春秋.天冬塊根藥用成分對小鼠抗氧化延緩衰老的影響[J].湖南文理學院學報，2009，21（4）：41-43.

[7] 韋樹根，馬小軍，柯 芳，等.天冬新品種藥園天冬2號的選育與栽培技術[J].作物雜志，2011（4）：107-108.

[8] 吳 華，單秀梅.天門冬人工栽培技術[J].中國林副特產，2012（4）：76-77.

[9] 曾桂萍，潘化仁.中藥天冬葉片DNA的提取方法比較研究[J].貴州農業科學，2009，37（6）：18-20.

[10] 曾桂萍，潘化仁，劉紅昌.正交優化設計天冬ISSR反應體系的研究[J].種子，2009，28（5）：49-51，55.

[11] SASSA H.A technique to isolate DNA from woody and herbaceous plants by using a silica-cased plasmid extraction column[J].Analytical Biochemistry，2007，363：166-167.

[12] NIKOLOUDAKIS N，BANILAS G，GAZIS F，et al.Discrimination and genetic diversity among cultivated olive of Greece using RAPD marker[J].J Amer Soc Hort Sci，2003，128（5）：741-746.

[13] WANG D H，SONG K M，KREADER C，et al.A high-throughput system for the rapid extraction of plant genomic DNA for genome mapping and marker-assisted breeding studies[J].Journal of Association for Laboratory Automation，2005，10（4）：242-245.

[14] POREBSKI S L，BAILEY G，BAUM R B.Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plant containing high polysaccharide and polyphenol compinents[J]. Plant Mol Rep，1997（12）：8-15.

[15] 羅志勇，周 鋼，陳湘暉，等.高質量植物基因組DNA的分離[J].湖南醫科大學學報，2001，26（2）：178-180.

[16] 李 莉，彭建營，白瑞霞.不同方法對棗葉總DNA提取效果的影響[J].果樹學報，2007，24（3）：389-392.

[17] 陸嘉惠，李學禹，馬 淼，等.甘草屬植物DNA提取方法研究[J].生物技術，2006，16（3）：45-47.

[18] 薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆實驗指南（第3版）[M].黃培堂譯.北京：科學出版社，2002，463-469.

改良CTAB法提取植物基因組DNA過程中，通過氯仿-異戊醇抽提，除去蛋白質等雜質，試驗發現，抽提1次，尚有雜質殘留，抽提3次，DNA產率降低，而抽提2次的DNA質量較高，這與陸嘉惠等[17]的報道基本一致。

植物基因組DNA提取方法較多，但其原理基本相同，主要包括破碎細胞、裂解細胞或組織，以去詬劑溶解細胞膜，從而促使蛋白質變性，再用氯仿-異戊醇等有機溶劑對DNA進行抽提純化。由于核酸基本集中在細胞內，所以研磨的質量好壞是提取基因組DNA的關鍵，只有充分研磨，細胞才能破碎，核酸才得以釋放[18]。

本試驗是在CTAB法的基礎上進行改良的，以傳統的CTAB法為對照，但是由于成熟葉片富含多糖、多酚、蛋白質和其他次生代謝物質，傳統的CTAB法無法提取天門冬的DNA，電泳結果為空白，故本試驗只對改良CTAB法進行分析和PCR擴增驗證。

參考文獻：

[1] 中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學工業出版社，2010.

[2] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志（第十五卷）[M].北京：科學出版社，1978.106-108.

[3] 王海萍，陳雪芬.中藥材天門冬的鑒別及其臨床應用[J].中藥現代藥物應用，2008，2（8）：39-40.

[4] 李志孝，黃成鋼，蔡育軍，等.天門冬多糖的化學結構及體外抗氧化活性[J].藥學學報，2000，35（5）：358-362.

[5] 徐從立，陳海生，譚興起，等.中藥天冬的化學成分研究[J].天然產物研究與開發，2005，17（2）：128-130.

[6] 熊大勝，許云香，郭春秋.天冬塊根藥用成分對小鼠抗氧化延緩衰老的影響[J].湖南文理學院學報，2009，21（4）：41-43.

[7] 韋樹根，馬小軍，柯 芳，等.天冬新品種藥園天冬2號的選育與栽培技術[J].作物雜志，2011（4）：107-108.

[8] 吳 華，單秀梅.天門冬人工栽培技術[J].中國林副特產，2012（4）：76-77.

[9] 曾桂萍，潘化仁.中藥天冬葉片DNA的提取方法比較研究[J].貴州農業科學，2009，37（6）：18-20.

[10] 曾桂萍，潘化仁，劉紅昌.正交優化設計天冬ISSR反應體系的研究[J].種子，2009，28（5）：49-51，55.

[11] SASSA H.A technique to isolate DNA from woody and herbaceous plants by using a silica-cased plasmid extraction column[J].Analytical Biochemistry，2007，363：166-167.

[12] NIKOLOUDAKIS N，BANILAS G，GAZIS F，et al.Discrimination and genetic diversity among cultivated olive of Greece using RAPD marker[J].J Amer Soc Hort Sci，2003，128（5）：741-746.

[13] WANG D H，SONG K M，KREADER C，et al.A high-throughput system for the rapid extraction of plant genomic DNA for genome mapping and marker-assisted breeding studies[J].Journal of Association for Laboratory Automation，2005，10（4）：242-245.

[14] POREBSKI S L，BAILEY G，BAUM R B.Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plant containing high polysaccharide and polyphenol compinents[J]. Plant Mol Rep，1997（12）：8-15.

[15] 羅志勇，周 鋼，陳湘暉，等.高質量植物基因組DNA的分離[J].湖南醫科大學學報，2001，26（2）：178-180.

[16] 李 莉，彭建營，白瑞霞.不同方法對棗葉總DNA提取效果的影響[J].果樹學報，2007，24（3）：389-392.

[17] 陸嘉惠，李學禹，馬 淼，等.甘草屬植物DNA提取方法研究[J].生物技術，2006，16（3）：45-47.

[18] 薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆實驗指南（第3版）[M].黃培堂譯.北京：科學出版社，2002，463-469.

改良CTAB法提取植物基因組DNA過程中，通過氯仿-異戊醇抽提，除去蛋白質等雜質，試驗發現，抽提1次，尚有雜質殘留，抽提3次，DNA產率降低，而抽提2次的DNA質量較高，這與陸嘉惠等[17]的報道基本一致。

植物基因組DNA提取方法較多，但其原理基本相同，主要包括破碎細胞、裂解細胞或組織，以去詬劑溶解細胞膜，從而促使蛋白質變性，再用氯仿-異戊醇等有機溶劑對DNA進行抽提純化。由于核酸基本集中在細胞內，所以研磨的質量好壞是提取基因組DNA的關鍵，只有充分研磨，細胞才能破碎，核酸才得以釋放[18]。

本試驗是在CTAB法的基礎上進行改良的，以傳統的CTAB法為對照，但是由于成熟葉片富含多糖、多酚、蛋白質和其他次生代謝物質，傳統的CTAB法無法提取天門冬的DNA，電泳結果為空白，故本試驗只對改良CTAB法進行分析和PCR擴增驗證。

參考文獻：

[1] 中華人民共和國國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學工業出版社，2010.

[2] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志（第十五卷）[M].北京：科學出版社，1978.106-108.

[3] 王海萍，陳雪芬.中藥材天門冬的鑒別及其臨床應用[J].中藥現代藥物應用，2008，2（8）：39-40.

[4] 李志孝，黃成鋼，蔡育軍，等.天門冬多糖的化學結構及體外抗氧化活性[J].藥學學報，2000，35（5）：358-362.

[5] 徐從立，陳海生，譚興起，等.中藥天冬的化學成分研究[J].天然產物研究與開發，2005，17（2）：128-130.

[6] 熊大勝，許云香，郭春秋.天冬塊根藥用成分對小鼠抗氧化延緩衰老的影響[J].湖南文理學院學報，2009，21（4）：41-43.

[7] 韋樹根，馬小軍，柯 芳，等.天冬新品種藥園天冬2號的選育與栽培技術[J].作物雜志，2011（4）：107-108.

[8] 吳 華，單秀梅.天門冬人工栽培技術[J].中國林副特產，2012（4）：76-77.

[9] 曾桂萍，潘化仁.中藥天冬葉片DNA的提取方法比較研究[J].貴州農業科學，2009，37（6）：18-20.

[10] 曾桂萍，潘化仁，劉紅昌.正交優化設計天冬ISSR反應體系的研究[J].種子，2009，28（5）：49-51，55.

[11] SASSA H.A technique to isolate DNA from woody and herbaceous plants by using a silica-cased plasmid extraction column[J].Analytical Biochemistry，2007，363：166-167.

[12] NIKOLOUDAKIS N，BANILAS G，GAZIS F，et al.Discrimination and genetic diversity among cultivated olive of Greece using RAPD marker[J].J Amer Soc Hort Sci，2003，128（5）：741-746.

[13] WANG D H，SONG K M，KREADER C，et al.A high-throughput system for the rapid extraction of plant genomic DNA for genome mapping and marker-assisted breeding studies[J].Journal of Association for Laboratory Automation，2005，10（4）：242-245.

[14] POREBSKI S L，BAILEY G，BAUM R B.Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plant containing high polysaccharide and polyphenol compinents[J]. Plant Mol Rep，1997（12）：8-15.

[15] 羅志勇，周 鋼，陳湘暉，等.高質量植物基因組DNA的分離[J].湖南醫科大學學報，2001，26（2）：178-180.

[16] 李 莉，彭建營，白瑞霞.不同方法對棗葉總DNA提取效果的影響[J].果樹學報，2007，24（3）：389-392.

[17] 陸嘉惠，李學禹，馬 淼，等.甘草屬植物DNA提取方法研究[J].生物技術，2006，16（3）：45-47.

[18] 薩姆布魯克J，拉塞爾D W.分子克隆實驗指南（第3版）[M].黃培堂譯.北京：科學出版社，2002，463-469.