基于3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的肺癌類干細胞的分離和鑒定*

劉芃芃 于文文 程亞楠 韓 雷 陳永孜 魏熙胤 李 慧任秀寶 于津浦

·基礎研究·

基于3D細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的肺癌類干細胞的分離和鑒定*

劉芃芃①②于文文②程亞楠①韓 雷①陳永孜③魏熙胤④李 慧②任秀寶②于津浦①②

目的：本研究建立三維細胞培養(yǎng)方法（3D）以分離和鑒定肺癌類干細胞，并與二維細胞培養(yǎng)方法（2D）比較，初步探討該方法在評價肺癌體外增殖、凋亡、侵襲和藥物反應性方面的應用。方法：將人肺腺癌細胞系A549以1×104個/孔的細胞與RPMI 1640和伊格爾基礎培養(yǎng)基（basal medium of eagle，BME）制成細胞懸液，培養(yǎng)7 d，收集細胞采用流式細胞儀進行類干細胞表型檢測，以及體外成球、耐藥性、體內成瘤等干細胞功能鑒定，并將3D與2D細胞培養(yǎng)的A549細胞進行比較。結果：細胞表型檢測證明3D系統(tǒng)培養(yǎng)的A549細胞中CD44和CD326陽性比例升高，CD24陽性比例下降，細胞體外成球率顯著升高（28.50%±1.17%vs. 8.67%±0.80%，P＜0.01）對順鉑耐藥性顯著提高。加藥后48 h為58.17%±2.19%vs.33.27%±5.76%（P＜0.01），加藥后72 h為41.70%±5.81%vs.27.30%±4.25%（P＜0.01），體內成瘤時間顯著縮短［（20.75±0.85）d vs.（60.25±1.49）d，P＜0.01］。結論：3D培養(yǎng)的肺癌細胞中獲得更高比例的類干細胞樣細胞，具有體內成瘤快、體外成克隆團率高、耐藥性提高的特征。

肺癌 3D細胞培養(yǎng) 腫瘤干細胞

肺癌是最常見的惡性腫瘤，目前在全世界范圍內發(fā)病率及病死率均位居前列［1］。盡管在分子分型和靶向治療上取得了重大的進展，但是肺癌的5年生存率并未得到有效改善，高復發(fā)仍然是肺癌致死的主要原因［2］。近年來，腫瘤干細胞在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的作用受到廣泛關注，研究表明，肺癌干細胞在肺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移、浸潤、復發(fā)和耐藥的過程中起著重要作用［3］。干細胞具備高增殖能力、高侵襲力、多向分化、化療抵抗和壽命長等特征，極大程度上影響了肺癌患者的預后。因此，建立特異性類干細胞培養(yǎng)方法對深入探討類干細胞特征，進一步闡明肺癌的發(fā)生和發(fā)展的分子機制，尋找更有效的肺癌靶向治療藥物具有重要意義。

文獻報道，在癌癥研究中3D細胞培養(yǎng)技術可以彌補傳統(tǒng)的2D細胞培養(yǎng)無法模擬細胞體內生存環(huán)境的缺陷，通過立體培養(yǎng)為細胞提供一個更加接近體內生存條件的微環(huán)境［4］。而且3D培養(yǎng)得到的細胞形態(tài)比2D的更加精確，細胞形態(tài)精確與否常常對細胞的功能產(chǎn)生影響［5］。為此，在前期研究基礎上建立一套基于3D的肺癌類干細胞培養(yǎng)和分離方法，將人肺腺癌細胞系A549接種至RPMI 1640培養(yǎng)基和BME為基礎的3D培養(yǎng)體系中，簡單易操作。本研究欲利用3D培養(yǎng)人肺腺癌細胞系A549，從中分離類干細胞，觀察其是否比2D的細胞系具有更強的增殖能力，更低的凋亡，更高的轉移潛能以及更差的藥物反應性［6-8］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 A549肺癌細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞中心，由本實驗室保存。

1.1.2 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、0.25%Trypsin胰蛋白酶、胎牛血清購自美國Hyclone公司，BME、回收液購自美國BD公司，二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司，Antibiotic-Antimycotic購自美國Invitrogen公司。細胞因子購自美國Sigma公司，F(xiàn)ITC標記的CD326抗體及同亞型對照IgG2b、PE標記的CD24抗體及同亞型對照IgG1、APC標記的CD44抗體及同亞型對照IgG1等均購自美國Biolegend公司，順鉑（cisplatin，DDP）注射液購自云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司，MTT購自美國Sigma公司。

1.1.3 動物 Scid裸鼠，體質量17～18 g，SPF級動物，由北京維通利華實驗動物技術有限公司繁育，動物證號為SYXK（京）2012-0001。本實驗經(jīng)科研機構委員會批準，符合國家有關實驗動物管理條例。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 實驗分為3D組和2D組2組。在2D培養(yǎng)組中A549細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞懸液，以細胞1×104個/孔接種于普通96孔板中，0.25%胰酶消化、傳代、到期后回收細胞。在3D培養(yǎng)組中以200 μL同樣的濃度加到已鋪好BME的96孔板里，到期后用分散酶消化BME、回收液回收細胞。誘導出的肺癌類干細胞，分別用于體內動物模型的建立以及類干細胞篩選。每組設置3個復孔為平行對照。

1.2.2 流式細胞儀檢測類干細胞特異性抗體 收集兩組培養(yǎng)3、7、11、14、20 d的細胞，分別制成細胞懸液，每管細胞調整為1×105個，分別用抗體標記物標記，進行流式細胞儀免疫表型檢測，鑒定類干細胞。

1.2.3 成球實驗 將2組培養(yǎng)7 d的細胞以5×103個/孔用無血清RPMI 1640培養(yǎng)基接種到6孔板中，7 d后觀察細胞的成球率。

1.2.4 藥物反應性實驗 將3D和2D培養(yǎng)7 d的A549細胞制成單細胞懸液，調整細胞濃度為1×105/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，空白對照孔只加培養(yǎng)液。置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，待細胞完全貼壁，次日分別加入100 μL含順鉑的培養(yǎng)基，每孔總體積為200 μL。每組做3個平行孔，分別培養(yǎng)24、48、72 h，而后每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，離心培養(yǎng)板，棄上清，加入DMSO 150 μL/孔，微量震蕩器輕微振蕩10 min，溶解結晶。在酶標儀490 nm波長下檢測各孔吸光度（OD值），按下列公式計算細胞存活率。細胞存活率＝實驗組OD值/對照組OD值×100%。MTT實驗在不同日重復3次。

1.2.5 體內動物模型建立 將2組培養(yǎng)7 d的細胞分別以細胞5×104個/只接種到Scid裸鼠體內，每組4只。每3天測量瘤塊的A（長）和B（寬），按下列公式計算瘤塊的體積。瘤塊體積（V）=3.14×A2×B/6，并繪制生長曲線，X軸代表體內接種后的天數(shù)，Y軸代表測量的瘤塊體積。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采用單因素方差分析或t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3D培養(yǎng)細胞的表型鑒定

2.1.1 3D培養(yǎng)的肺癌細胞表面抗體檢測 CD326、CD44陽性率升高，CD24陽性率降低為干細胞鑒定指標。結果表明，3D培養(yǎng)7 d的A549細胞表面CD326與CD44雙陽性比例顯著高于2D培養(yǎng)組（15.33%± 0.55%vs.1.50%±0.53%，56.13%±2.98%vs.6.23%± 0.91%，P＜0.01，圖1），但CD24明顯低于2D培養(yǎng)組（1.10%±0.26%vs.67.63%±0.94%，P＜0.01）。這說明經(jīng)過3D培養(yǎng)的細胞內有大量的肺癌類干細胞存在。

2.2 3D培養(yǎng)細胞的功能檢測

2.2.1 成球實驗 干細胞可以形成單克隆微球體，直徑超過70 μm被認為是1個單克隆微球體。A549細胞培養(yǎng)7 d后，3D培養(yǎng)的要比2D培養(yǎng)的細胞成球率高（28.50%±1.17%vs.8.67%±0.80%，P＜0.05，圖2），這說明3D培養(yǎng)出了更高比例的類干細胞樣細胞。

圖1 比較3D和2D培養(yǎng)的肺癌類干細胞表面抗體陽性率Figure 1 Comparison of antibody positive rate in surface of lung cancer stem-like cells between 3D and 2D cultured

圖2 比較3D與2D培養(yǎng)肺癌細胞7 d后的成球率Figure 2 Comparison of balling rate for lung cancer cells between 3D and 2D cultured for 7 days

2.2.2 藥物反應性檢測 分別提取第7天3D培養(yǎng)和2D培養(yǎng)的A549細胞接種于96孔板（5×104/mL），同時加入順鉑，MTT法比較2種培養(yǎng)提取的細胞生長狀況。結果為2組細胞加入順鉑后，24 h細胞存活率無明顯區(qū)別（75.27%±1.99%vs.79.30%±3.48%，P＜0.01），但是在48 h和72 h，3D組細胞存活率均高于2D組（58.17%±2.19% vs.33.27%±5.76%，41.70%±5.81%vs.27.30%±4.25%，P＜0.05，圖3），表明3D培養(yǎng)的細胞較2D培養(yǎng)的細胞更具耐藥性。

圖3 比較3D與2D培養(yǎng)的肺癌細胞對藥物的反應性Figure 3 Comparison of drug resistance in lung cancer cells between 3D and 2D cultured

2.2.3 體內成瘤實驗 將2組培養(yǎng)出來的A549細胞以5×104個/只分別接種至Scid裸鼠體內，觀察腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。3D組的A549細胞接種小鼠成瘤至1 cm3的時間顯著少于2D［（20.75±0.85）d vs.（60.25±1.49）d，P＜0.01）］，腫瘤生長速度比2D快，接種后第20天腫瘤體積明顯大于2D組［（967.0±2.726）mm3vs.（346.1±2.023）mm3，P＜0.05，圖4］。

圖4 比較3D與2D培養(yǎng)的肺癌細胞在Scid裸鼠體內的成瘤生長曲線Figure 4 Comparison of tumor growth curves in vivo between 3D and 2D cultured lung cancer cells

3 討論

腫瘤干細胞假說認為，腫瘤干細胞具有對化療藥物的天然耐藥性，并與腫瘤細胞的生長、轉移和復發(fā)等密切相關。腫瘤干細胞在腫瘤細胞內數(shù)量極少但具有極強的繁殖和誘導正常細胞惡化能力，也是腫瘤獲得耐藥性的主要原因之一［9］。

傳統(tǒng)的2D方法在信號轉導、細胞擴增、模擬細胞體內生存環(huán)境等方面存在缺陷［10］。首先不能模擬正常組織中的化學信號或分子梯度［11］，干擾細胞表面蛋白質-蛋白質相互作用的信號轉導，進而影響細胞的主要代謝途徑和基因表達［12］。到目前為止，在2D中尚未找到有效的方法培養(yǎng)出足夠數(shù)量的腫瘤干細胞。

相對于2D，3D容納了更高密度的細胞黏附和增殖空間，有利于細胞間信號傳遞，更能夠模擬細胞體內生長環(huán)境，在細胞培養(yǎng)過程中，細胞形態(tài)比2D的更加接近體內生存微環(huán)境下的形態(tài)［13］。3D培養(yǎng)方法使細胞生長空間更大，營養(yǎng)物和代謝物流通順暢，同時也無體內眾多干擾因素存在，因此，更有利于腫瘤普通細胞，尤其是類干細胞自我繁殖形成克隆團，導致類干細胞比例明顯增多。

為進一步驗證3D培養(yǎng)的A549是否可以增殖出更多的肺癌類干細胞，本研究選擇了3種特異性肺癌干細胞表面抗體CD326、CD44和CD24，采用流式細胞分離術以鑒定肺癌類干細胞。CD326被稱為人類上皮抗原（HEA），是早期干細胞的特異性標記物之一，多表達在內皮祖細胞上［14］。CD44屬于黏附分子，可介導多種細胞與細胞、細胞與細胞外基質（ECM），促進T、B細胞分化以及T細胞活化，與腫瘤的關系主要表現(xiàn)在促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲、轉移兩個方面［15］。CD24是一種表達于髓核組織細胞表面的分子標記，能參與腫瘤細胞轉移和分化過程，為陰性標志物［16］。結果表明3D培養(yǎng)的A549細胞出現(xiàn)了CD326、CD44陽性比例升高和CD24比例降低，并且陽性率是2D的9.22倍，這說明經(jīng)過3D培養(yǎng)后肺癌類干細胞比例明顯增加。在此基礎上，本研究又進行了一系列功能學檢測，發(fā)現(xiàn)經(jīng)3D培養(yǎng)的A549細胞要比2D的細胞體外成球率高，對順鉑耐藥性顯著提高，體內成瘤時間短，這些都證明經(jīng)3D培養(yǎng)的A549細胞具有一定的干細胞功能特征，表明3D培養(yǎng)有大量的肺癌類干細胞存在。

綜上所述，3D培養(yǎng)有利于腫瘤類干細胞的生成，這為腫瘤干細胞的培養(yǎng)和篩選提供了一個更為有效迅速的方法，為腫瘤干細胞研究、靶向治療藥物研發(fā)和腫瘤臨床治療提供了有效手段。但本研究僅限于肺腺癌細胞系，是否適用于肺鱗癌細胞系、肺癌原代細胞、肝癌細胞系或者肝癌原代細胞，以及是否提高其干細胞比例還有待于進一步研究。

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（2014-03-26收稿）

（2014-06-16修回）

（本文編輯：楊紅欣）

劉芃芃 碩士。專業(yè)方向為腫瘤藥理學，包括利用3D培養(yǎng)分離干細胞研究。

E-mail：cgtwins@126.com

·讀者·作者·編者·

吸煙與ER陽性乳腺癌相關

根據(jù)一項新的研究結果，青年女性吸煙者罹患常見類型乳腺癌的風險升高。研究者發(fā)現(xiàn)，在20歲至44歲的女性人群中，平均每天吸煙一盒，煙齡超過10年者，患ER陽性乳腺癌的風險比少吸煙或不吸煙者高出60%。（Cancer 2014年2月10日在線版）。研究者們分析了2004-2010年間美國大西雅圖地區(qū)確診為乳腺癌的年輕女性群體資料。其中778例為ER陽性乳腺癌。另納入938名健康婦女作為對照。結果表明：曾經(jīng)吸煙的年輕女性罹患乳腺癌的幾率比從不吸煙者高30%。作者認為，香煙中可能存在一些物質，其作用類似雌激素，導致ER陽性乳腺癌的發(fā)生。

我國是世界上最大的煙草生產(chǎn)和消費國，每年因吸煙導致死亡的人數(shù)已超過100萬，至2050年將突破300萬，二手煙暴露也極為普遍。然而，我國公眾對吸煙的嚴重危害普遍缺乏認識，煙民中年輕人占據(jù)的比例仍在不斷攀升，部分人還抱有錯誤觀念，以致控煙的覺悟與動力不足。因此，以堅實的科學證據(jù)昭示吸煙危害是推動控煙的關鍵。

——引自《全球腫瘤快訊》

Isolation and identification of lung cancer stem-like cells based on a 3D cell culture system

Pengpeng LIU1,2,Wenwen YU2,Ya'nan CHENG1,Lei HAN1,Yongzi CHEN3,Xiyin WEI4,Hui LI2,Xiubao REN2,Jinpu YU1,2

Jinpu YU;E-mail:jinpu_yu@hotmail.com
1Cancer Molecular Diagnosis Core,Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital National Clinical Research Center for Cancer,Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Tianjin,China;2Department of Biotechnology,Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy;3Laboratory of Cancer Cell Biology;4Public Laboratory of Cancer Cell Biology,Tianjin 300060,China
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81272221)

Objective:To highlight the developmental process of 3D cell culture technology system,which is more suitable for isolating and identifying lung cancer stem-like cells than 2D cell culture technology system,and to explore the application of 3D cell cultures in the evaluation of proliferation,apoptosis,invasion,and drug resistance of lung cancer.Methods:Cells(104/well)from the human lung adenocarcinoma cell lines A549 and RPMI 1640 were cultured in complete medium containing 10%fetal bovine serum. Cell suspension was cultured in a BME basal medium.A growth curve was drawn after 7 d of culture.The stem-like cell was identified through a mammosphere culture,drug resistance and invasion assay,and flow cytometry.Data of A549 cells cultured in 3D and 2D traditional cell culture technologies were compared.Results:Cells from the 3D cell culture had higher tumor formation rates[(20.75± 0.85)d vs.(60.25±1.49)d,P＜0.01)]and tumor sphere formation(28.50%±1.17%vs.8.67%±0.80%,P＜0.01)than those from the 2D cell culture.Moreover,cells from 3D cell culture were more invasive and resistant to therapy(58.17%±2.19%vs.41.70%±5.81%in 48 h,P＜0.01;33.27%±5.76%vs.27.30%±4.25%in 72 h,P＜0.01).Phenotype experimental results demonstrated that the CD44 and CD326 cells were double-positive,whereas the CD24 cell was negative.Conclusion:The proportion of stem-like cells in A549 cell line after 3D cell culture significantly increased compared with 2D cell culture.The 3D cell culture can promote the proliferation of lung cancer stem cells.

lung neoplasms,3D cell culture,cancer stem cells

10.3969/j.issn.1000-8179.20140494

①天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院腫瘤分子診斷中心，國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市腫瘤防治重點實驗室（天津市300060）；②生物技術研究室，天津市腫瘤免疫與生物治療重點實驗室；③腫瘤細胞生物學實驗室；④公共實驗室

?本文課題受國家自然科學基金項目（編號：81272221）資助

于津浦 jinpu_yu@hotmail.com