余甘子果實多酚氧化酶活性影響因素研究

鄭麗平，丘春秀（等）

摘要：多酚氧化酶（PPO）是酶促褐變的關鍵酶，以余甘子（Phyllanthus emblica）果實PPO為研究對象，采用分光光度法研究余甘子果實PPO作用的最適底物，同時探究反應體系pH、反應溫度、底物濃度、抑制劑對余甘子果實中PPO活性的影響。結果表明，余甘子果實PPO作用的最佳底物為焦性沒食子酸，最適pH為6.0，最適反應溫度為10 ℃，底物最佳濃度為0.14 mol/L，抗壞血酸（VC）、檸檬酸、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸4種抑制劑對余甘子果實PPO活性均表現出不同程度的抑制作用，其中抗壞血酸對余甘子果實PPO活性抑制效果最好。

關鍵詞：余甘子（Phyllanthus emblica）；多酚氧化酶（PPO）；活性；抑制劑

中圖分類號：R284.1；Q946.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）07-1621-04

Factors Affecting Activities of Polyphenol Oxidase in Phyllanthus emblica

ZHENG Li-ping，QIU Chun-xiu，CHEN Xiao-hong，WANG Hui-min，ZHANG Fu-ping

（Department of Biology， Hanshan Normal University， Chaozhou 521041， Guangdong，China）

Abstract： Polyphenol oxidase（PPO） was the key enzyme of enzymatic browning. The optimal substrate to PPO of Phyllanthus emblica and effects of pH，temperature，concentration of substrate and inhibitor on PPO activity were studied with spectrophotometry. The results showed that the optimal substrate was pyrogallic acid. The optimal pH， temperature and concentration of substrate were 6.0， 10 ℃ and 0.14 mol/L， respectively. Vitamin C， citric acid， Na2SO3 and L-Cysteine had inhibition effects on PPO activity in different degree. Vitamin C had the best inhibition effect on PPO activity in the fruit of phyllanthus emblica.

Key words： Phyllanthus emblica； polyphenol oxidase（PPO）； activity； inhibitor

余甘子（Phyllanthus emblica）屬大戟科（Euphorbiaceae）葉下珠屬植物，其果鮮食酸甜酥脆而微澀，初食味酸澀，良久乃甘，故名“余甘子”。余甘子樹耐旱耐瘠，適應性強，喜光喜溫，一般樹高1～3 m，單果重15 g左右。研究表明，余甘子果實中含有豐富的超氧化物歧化酶、維生素C、多酚類物質及多糖等活性物質[1]。余甘子果實味酸微澀，清熱涼血，消食健脾，生津止渴。主治血熱血瘀、消化不良、腹脹、咳嗽、喉痛、口干及維生素C缺乏癥。在藏藥中，余甘子主治培根病、赤巴病、血病、高血壓病等[2]。近年研究結果表明，余甘子具有抗炎、抗氧化、抗衰老、保肝等作用[3]，而其強烈的抗氧化活性是其生理功能的基礎[4]。果實采后褐變會直接影響果實的品質和商品價值。果蔬采后的褐變主要是多酚氧化酶（PPO）引起的，多酚氧化酶是一類含Cu元素的膜結合蛋白，它催化果蔬體內的多酚類物質氧化形成醌，后者自身縮合或與細胞內蛋白質結合，形成褐色或黑色物質。對于余甘子果實的保鮮，關鍵就在于抑制PPO的活性。目前已有許多試驗研究了不同果實中的PPO[5-14]，而對于余甘子的相關研究報道則較少。本試驗對余甘子果實PPO活性的影響因素進行了探究，旨在為其采后的保鮮與加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：余甘子果實（普通品種）購自廣東潮州市農貿市場。

試劑：檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、抗壞血酸（VC）、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸、焦性沒食子酸、鄰苯二酚、對苯二酚、間苯二酚、磷酸、醋酸等均為分析純。

儀器：PHS-3CA型精密酸度計（上海大中分析儀器廠）；UV-2800型紫外分光光度計[尤尼柯（上海）儀器有限公司]；電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；恒溫干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司）；16R型高速冷凍離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（江蘇金壇億通電子有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 PPO酶液的提取 將新鮮、無機械損傷、無病蟲害的余甘子果實洗凈，然后取10 g余甘子果肉，加入預冷的0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸鹽緩沖液10 mL于低溫（冰水中）搗碎至勻漿，6 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液，低溫（0～4 ℃）保存。

1.2.2 最佳底物選擇試驗 將各種酚類物質（焦性沒食子酸、鄰苯二酚、對苯二酚、間苯二酚）分別用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸鹽緩沖溶液配制成0.1 mol/L溶液作為PPO作用的底物。取底物溶液11.2 mL，加入PPO粗酶提取液0.8 mL，搖勻，于25 ℃保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應。在420 nm波長下測定其吸光度（A）并計算PPO相對活性，以確定余甘子果實PPO作用的最佳底物。

1.2.3 PPO活性測定 采用晏紹慶等[11]的測定方法并稍作修改。將“1.2.2”中選出的最佳底物焦性沒食子酸用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸鹽緩沖溶液配制成0.1 mol/L的溶液作為酶的底物，取底物溶液11.2 mL，再加入粗酶液0.8 mL，于25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應。然后在波長420 nm處比色，測定吸光度A，計算PPO的活性。以每毫升酶液反應后每分鐘吸光度值增加0.001定義為1個酶活單位（U）。

PPO活性=ΔA420 nm×VT/（W×VS×0.001×t）

式中，ΔA420 nm為樣品吸光度與空白對照吸光度之差，VT為提取酶液總體積（mL），W為待測材料質量（g），VS為測定時取用酶液體積（mL），t為反應時間（min）。PPO活性單位為U/（g·min）。

1.2.4 pH對PPO活性的影響 取0.1 mol/L的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調整反應體系的pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0），在25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.5 反應溫度對PPO活性的影響 取0.1 mol/L的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調整反應體系的pH為6.0，在不同的溫度（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃）下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.6 底物濃度對PPO活性的影響 取不同濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mol/L）的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調整反應體系的pH為6.0，于25 ℃下保溫5 min，然后用50 μL濃鹽酸終止反應。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.7 抑制劑對PPO活性的影響 將抑制劑抗壞血酸（VC）、檸檬酸、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸分別用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸鹽緩沖溶液配制成0.02 mol/L的溶液，分別取上述抑制劑2.0 mL，加入焦性沒食子酸（0.14 mol/L）溶液9.2 mL，再加入粗酶液0.8 mL。在25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

2 結果與分析

2.1 最佳底物選擇試驗結果

由圖1可知，以焦性沒食子酸為底物時余甘子果實PPO活性最大，即焦性沒食子酸是余甘子果實PPO作用的最佳底物。

2.2 pH對余甘子果實PPO活性的影響

由圖2可知，余甘子果實PPO作用的最適pH為6.0，在pH小于3.0和大于9.0時，果實的PPO活性受抑制的趨勢越來越明顯。這是因為PPO是一種含Cu離子的蛋白質，在強酸條件下，Cu離子被解離出來使酶失活，而且較高的酸性也使蛋白質變性導致酶失活；在堿性條件下，Cu離子與酶蛋白脫離，生成不溶性的Cu（OH）2，也可使酶失活。因此，在進行果品加工處理時，可調節環境的pH，使果實PPO失活，從而減輕其褐變的發生率。

2.3 反應溫度對余甘子果實PPO活性的影響

反應溫度對PPO活性的影響如圖3所示。由圖3可以看出，反應溫度在0～60 ℃時，余甘子果實PPO活性呈現先上升后下降的趨勢，0～10 ℃范圍內，隨著溫度的上升，余甘子果實PPO活性上升迅速；10～30 ℃時，隨溫度升高余甘子果實PPO活性下降明顯，當溫度高于30 ℃時，余甘子果實PPO活性變化不大，處于較低水平。余甘子果實PPO活性的峰值出現在10 ℃，即PPO作用的最適溫度為10 ℃，這與紀淑娟等[14]報道的蜜柚PPO作用的最適溫度為10 ℃相一致。但在0 ℃時發現余甘子有凍傷現象，所以0 ℃不宜作為其貯存的溫度。

2.4 底物濃度對余甘子果實PPO活性的影響

由圖4可知，在供試反應體系中，當焦性沒食子酸濃度為0.02～0.14 mol/L時，余甘子果實PPO活性呈上升趨勢，且在0.14 mol/L時達到最大；當焦性沒食子酸濃度為0.14～0.20 mo1/L時，余甘子果實PPO活性的變化趨于平緩。這是因為底物濃度較低時，有一些酶的活性部位并沒有與底物結合，隨著底物濃度增加，越來越多的酶活性部位與底物相結合，使酶促反應進行；在達到一定濃度后，所有的酶活性部位都與底物結合，此時酶活性部位被底物飽和，進一步提高底物濃度也不能提高酶活性，酶活性達到最大值。

2.5 抑制劑對余甘子果實PPO活性的影響

由圖5可以看出，4種抑制劑對余甘子果實PPO活性均表現出不同程度的抑制效果。其抑制效果由強到弱分別為抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸鈉、檸檬酸。抗壞血酸對余甘子果實PPO活性的抑制效果好于其他3種。抗壞血酸等4種抑制劑可以作為醌的還原劑，也可以作為酶分子中Cu離子的螯合劑，能夠與酶促褐變的中間產物生成穩定無色的產物，阻止了黑色素的生成，從而抑制了PPO的活性。

3 小結與討論

余甘子果實的褐變與余甘子PPO活性變化密切相關，而PPO活性的抑制是多因素綜合作用的結果。本試驗結果顯示，余甘子果實中PPO活性作用的最佳底物為焦性沒食子酸，在該底物作用條件下，余甘子果實中PPO作用的最適pH為6.0，在pH為5.0～7.0之間活性最大，因此，通過控制果品加工環境的pH，可在一定程度上減輕果實褐變的速度。余甘子果實中PPO作用的最適溫度為10 ℃。底物濃度對余甘子果實PPO活性也有影響，在焦性沒食子酸處于低濃度時，隨著底物濃度增加，余甘子果實PPO的活性不斷升高，當底物濃度在0.14 mol/L時，PPO的活性達到最高，之后再增加底物濃度對酶的活性影響不大。抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸等抑制劑對余甘子果實PPO活性均具有一定的抑制作用。在相同濃度的單一抑制劑作用下，其抑制效果依次為抗壞血酸>L-半胱氨酸>亞硫酸鈉>檸檬酸。抗壞血酸對余甘子果實PPO活性有較好的抑制作用，而且其抑制效果隨著抗壞血酸濃度的增加而升高。抗壞血酸處理對保持果實的貯藏品質和減少損失有重要意義，其作為一種安全、方便的處理方式，在果蔬保鮮方面具有廣闊的應用前景。

參考文獻：

[1] 吳雪輝，謝志芳，黃永芳.余甘子的化學成分與保健功能作用[J].中國野生植物資源，2003，22（6）：69-71.

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[4] 劉曉麗，吳克剛，柴向華，等.余甘子多酚作為食用油脂抗氧化劑的研究[J].中國食品添加劑，2010（3）：194-198.

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[9] 張福平，張少英.山竹果皮多酚氧化酶酶學特性及抑制效應的研究[J].廣東農業科學，2011（8）：80-82.

[10] 張福平，劉志聰，陳為鑫，等.蓮霧果實多酚氧化酶的特性及抑制劑研究[J].湖北農業科學，2012，51（13）：2764-2766.

[11] 晏紹慶，華澤釗，劉寶林，等.玻璃化保存草莓多酚氧化酶和過氧化物酶活性變化的實驗研究[J].食品科學，2000，21（1）：58-62.

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[13] 沈金玉，黃家音，李曉莉.蘆薈多酚氧化酶特性的研究[J].食品與發酵工業，2005，31（3）：21-25.

[14] 紀淑娟，尹競男，李家政.蜜柚多酚氧化酶的酶學特性與活性測定研究[J].北方園藝，2010（17）：171-174.

1.2.3 PPO活性測定 采用晏紹慶等[11]的測定方法并稍作修改。將“1.2.2”中選出的最佳底物焦性沒食子酸用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸鹽緩沖溶液配制成0.1 mol/L的溶液作為酶的底物，取底物溶液11.2 mL，再加入粗酶液0.8 mL，于25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應。然后在波長420 nm處比色，測定吸光度A，計算PPO的活性。以每毫升酶液反應后每分鐘吸光度值增加0.001定義為1個酶活單位（U）。

PPO活性=ΔA420 nm×VT/（W×VS×0.001×t）

式中，ΔA420 nm為樣品吸光度與空白對照吸光度之差，VT為提取酶液總體積（mL），W為待測材料質量（g），VS為測定時取用酶液體積（mL），t為反應時間（min）。PPO活性單位為U/（g·min）。

1.2.4 pH對PPO活性的影響 取0.1 mol/L的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調整反應體系的pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0），在25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.5 反應溫度對PPO活性的影響 取0.1 mol/L的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調整反應體系的pH為6.0，在不同的溫度（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃）下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.6 底物濃度對PPO活性的影響 取不同濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mol/L）的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調整反應體系的pH為6.0，于25 ℃下保溫5 min，然后用50 μL濃鹽酸終止反應。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.7 抑制劑對PPO活性的影響 將抑制劑抗壞血酸（VC）、檸檬酸、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸分別用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸鹽緩沖溶液配制成0.02 mol/L的溶液，分別取上述抑制劑2.0 mL，加入焦性沒食子酸（0.14 mol/L）溶液9.2 mL，再加入粗酶液0.8 mL。在25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

2 結果與分析

2.1 最佳底物選擇試驗結果

由圖1可知，以焦性沒食子酸為底物時余甘子果實PPO活性最大，即焦性沒食子酸是余甘子果實PPO作用的最佳底物。

2.2 pH對余甘子果實PPO活性的影響

由圖2可知，余甘子果實PPO作用的最適pH為6.0，在pH小于3.0和大于9.0時，果實的PPO活性受抑制的趨勢越來越明顯。這是因為PPO是一種含Cu離子的蛋白質，在強酸條件下，Cu離子被解離出來使酶失活，而且較高的酸性也使蛋白質變性導致酶失活；在堿性條件下，Cu離子與酶蛋白脫離，生成不溶性的Cu（OH）2，也可使酶失活。因此，在進行果品加工處理時，可調節環境的pH，使果實PPO失活，從而減輕其褐變的發生率。

2.3 反應溫度對余甘子果實PPO活性的影響

反應溫度對PPO活性的影響如圖3所示。由圖3可以看出，反應溫度在0～60 ℃時，余甘子果實PPO活性呈現先上升后下降的趨勢，0～10 ℃范圍內，隨著溫度的上升，余甘子果實PPO活性上升迅速；10～30 ℃時，隨溫度升高余甘子果實PPO活性下降明顯，當溫度高于30 ℃時，余甘子果實PPO活性變化不大，處于較低水平。余甘子果實PPO活性的峰值出現在10 ℃，即PPO作用的最適溫度為10 ℃，這與紀淑娟等[14]報道的蜜柚PPO作用的最適溫度為10 ℃相一致。但在0 ℃時發現余甘子有凍傷現象，所以0 ℃不宜作為其貯存的溫度。

2.4 底物濃度對余甘子果實PPO活性的影響

由圖4可知，在供試反應體系中，當焦性沒食子酸濃度為0.02～0.14 mol/L時，余甘子果實PPO活性呈上升趨勢，且在0.14 mol/L時達到最大；當焦性沒食子酸濃度為0.14～0.20 mo1/L時，余甘子果實PPO活性的變化趨于平緩。這是因為底物濃度較低時，有一些酶的活性部位并沒有與底物結合，隨著底物濃度增加，越來越多的酶活性部位與底物相結合，使酶促反應進行；在達到一定濃度后，所有的酶活性部位都與底物結合，此時酶活性部位被底物飽和，進一步提高底物濃度也不能提高酶活性，酶活性達到最大值。

2.5 抑制劑對余甘子果實PPO活性的影響

由圖5可以看出，4種抑制劑對余甘子果實PPO活性均表現出不同程度的抑制效果。其抑制效果由強到弱分別為抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸鈉、檸檬酸。抗壞血酸對余甘子果實PPO活性的抑制效果好于其他3種。抗壞血酸等4種抑制劑可以作為醌的還原劑，也可以作為酶分子中Cu離子的螯合劑，能夠與酶促褐變的中間產物生成穩定無色的產物，阻止了黑色素的生成，從而抑制了PPO的活性。

3 小結與討論

余甘子果實的褐變與余甘子PPO活性變化密切相關，而PPO活性的抑制是多因素綜合作用的結果。本試驗結果顯示，余甘子果實中PPO活性作用的最佳底物為焦性沒食子酸，在該底物作用條件下，余甘子果實中PPO作用的最適pH為6.0，在pH為5.0～7.0之間活性最大，因此，通過控制果品加工環境的pH，可在一定程度上減輕果實褐變的速度。余甘子果實中PPO作用的最適溫度為10 ℃。底物濃度對余甘子果實PPO活性也有影響，在焦性沒食子酸處于低濃度時，隨著底物濃度增加，余甘子果實PPO的活性不斷升高，當底物濃度在0.14 mol/L時，PPO的活性達到最高，之后再增加底物濃度對酶的活性影響不大。抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸等抑制劑對余甘子果實PPO活性均具有一定的抑制作用。在相同濃度的單一抑制劑作用下，其抑制效果依次為抗壞血酸>L-半胱氨酸>亞硫酸鈉>檸檬酸。抗壞血酸對余甘子果實PPO活性有較好的抑制作用，而且其抑制效果隨著抗壞血酸濃度的增加而升高。抗壞血酸處理對保持果實的貯藏品質和減少損失有重要意義，其作為一種安全、方便的處理方式，在果蔬保鮮方面具有廣闊的應用前景。

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[14] 紀淑娟，尹競男，李家政.蜜柚多酚氧化酶的酶學特性與活性測定研究[J].北方園藝，2010（17）：171-174.

1.2.3 PPO活性測定 采用晏紹慶等[11]的測定方法并稍作修改。將“1.2.2”中選出的最佳底物焦性沒食子酸用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸鹽緩沖溶液配制成0.1 mol/L的溶液作為酶的底物，取底物溶液11.2 mL，再加入粗酶液0.8 mL，于25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應。然后在波長420 nm處比色，測定吸光度A，計算PPO的活性。以每毫升酶液反應后每分鐘吸光度值增加0.001定義為1個酶活單位（U）。

PPO活性=ΔA420 nm×VT/（W×VS×0.001×t）

式中，ΔA420 nm為樣品吸光度與空白對照吸光度之差，VT為提取酶液總體積（mL），W為待測材料質量（g），VS為測定時取用酶液體積（mL），t為反應時間（min）。PPO活性單位為U/（g·min）。

1.2.4 pH對PPO活性的影響 取0.1 mol/L的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調整反應體系的pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0），在25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.5 反應溫度對PPO活性的影響 取0.1 mol/L的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調整反應體系的pH為6.0，在不同的溫度（0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 ℃）下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.6 底物濃度對PPO活性的影響 取不同濃度（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 mol/L）的焦性沒食子酸11.2 mL作為底物，加入PPO粗酶液0.8 mL，調整反應體系的pH為6.0，于25 ℃下保溫5 min，然后用50 μL濃鹽酸終止反應。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

1.2.7 抑制劑對PPO活性的影響 將抑制劑抗壞血酸（VC）、檸檬酸、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸分別用0.2 mol/L（pH 6.5）的磷酸鹽緩沖溶液配制成0.02 mol/L的溶液，分別取上述抑制劑2.0 mL，加入焦性沒食子酸（0.14 mol/L）溶液9.2 mL，再加入粗酶液0.8 mL。在25 ℃下保溫5 min，加入50 μL濃鹽酸終止反應。按照“1.2.3”的方法測定PPO活性。

2 結果與分析

2.1 最佳底物選擇試驗結果

由圖1可知，以焦性沒食子酸為底物時余甘子果實PPO活性最大，即焦性沒食子酸是余甘子果實PPO作用的最佳底物。

2.2 pH對余甘子果實PPO活性的影響

由圖2可知，余甘子果實PPO作用的最適pH為6.0，在pH小于3.0和大于9.0時，果實的PPO活性受抑制的趨勢越來越明顯。這是因為PPO是一種含Cu離子的蛋白質，在強酸條件下，Cu離子被解離出來使酶失活，而且較高的酸性也使蛋白質變性導致酶失活；在堿性條件下，Cu離子與酶蛋白脫離，生成不溶性的Cu（OH）2，也可使酶失活。因此，在進行果品加工處理時，可調節環境的pH，使果實PPO失活，從而減輕其褐變的發生率。

2.3 反應溫度對余甘子果實PPO活性的影響

反應溫度對PPO活性的影響如圖3所示。由圖3可以看出，反應溫度在0～60 ℃時，余甘子果實PPO活性呈現先上升后下降的趨勢，0～10 ℃范圍內，隨著溫度的上升，余甘子果實PPO活性上升迅速；10～30 ℃時，隨溫度升高余甘子果實PPO活性下降明顯，當溫度高于30 ℃時，余甘子果實PPO活性變化不大，處于較低水平。余甘子果實PPO活性的峰值出現在10 ℃，即PPO作用的最適溫度為10 ℃，這與紀淑娟等[14]報道的蜜柚PPO作用的最適溫度為10 ℃相一致。但在0 ℃時發現余甘子有凍傷現象，所以0 ℃不宜作為其貯存的溫度。

2.4 底物濃度對余甘子果實PPO活性的影響

由圖4可知，在供試反應體系中，當焦性沒食子酸濃度為0.02～0.14 mol/L時，余甘子果實PPO活性呈上升趨勢，且在0.14 mol/L時達到最大；當焦性沒食子酸濃度為0.14～0.20 mo1/L時，余甘子果實PPO活性的變化趨于平緩。這是因為底物濃度較低時，有一些酶的活性部位并沒有與底物結合，隨著底物濃度增加，越來越多的酶活性部位與底物相結合，使酶促反應進行；在達到一定濃度后，所有的酶活性部位都與底物結合，此時酶活性部位被底物飽和，進一步提高底物濃度也不能提高酶活性，酶活性達到最大值。

2.5 抑制劑對余甘子果實PPO活性的影響

由圖5可以看出，4種抑制劑對余甘子果實PPO活性均表現出不同程度的抑制效果。其抑制效果由強到弱分別為抗壞血酸、L-半胱氨酸、亞硫酸鈉、檸檬酸。抗壞血酸對余甘子果實PPO活性的抑制效果好于其他3種。抗壞血酸等4種抑制劑可以作為醌的還原劑，也可以作為酶分子中Cu離子的螯合劑，能夠與酶促褐變的中間產物生成穩定無色的產物，阻止了黑色素的生成，從而抑制了PPO的活性。

3 小結與討論

余甘子果實的褐變與余甘子PPO活性變化密切相關，而PPO活性的抑制是多因素綜合作用的結果。本試驗結果顯示，余甘子果實中PPO活性作用的最佳底物為焦性沒食子酸，在該底物作用條件下，余甘子果實中PPO作用的最適pH為6.0，在pH為5.0～7.0之間活性最大，因此，通過控制果品加工環境的pH，可在一定程度上減輕果實褐變的速度。余甘子果實中PPO作用的最適溫度為10 ℃。底物濃度對余甘子果實PPO活性也有影響，在焦性沒食子酸處于低濃度時，隨著底物濃度增加，余甘子果實PPO的活性不斷升高，當底物濃度在0.14 mol/L時，PPO的活性達到最高，之后再增加底物濃度對酶的活性影響不大。抗壞血酸、檸檬酸、亞硫酸鈉、L-半胱氨酸等抑制劑對余甘子果實PPO活性均具有一定的抑制作用。在相同濃度的單一抑制劑作用下，其抑制效果依次為抗壞血酸>L-半胱氨酸>亞硫酸鈉>檸檬酸。抗壞血酸對余甘子果實PPO活性有較好的抑制作用，而且其抑制效果隨著抗壞血酸濃度的增加而升高。抗壞血酸處理對保持果實的貯藏品質和減少損失有重要意義，其作為一種安全、方便的處理方式，在果蔬保鮮方面具有廣闊的應用前景。

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