鵝坦布蘇病毒E蛋白質結構域Ⅰ和ⅠⅠ在大腸桿菌中的表達及鑒定

趙冬敏， 黃欣梅， 劉宇卓， 韓凱凱， 謝星星， 劉曉燕， 李 銀

(江蘇省農業科學院獸醫研究所，農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室，國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇南京 210014)

鵝坦布蘇病毒(Goose tembusu virus，GTV)屬于黃病毒科黃病毒屬，該病毒引起坦布蘇病毒病，又稱產蛋下降綜合癥、傳染性卵巢炎，是以產蛋率、采食量顯著下降，出現腦炎樣神經癥狀為特征的新型傳染病。2010年4月至11月首次在中國暴發并迅速傳播到國內主要鴨鵝養殖地區，包括浙江、福建、廣東、廣西、安徽、江蘇、江西、河南、山東、河北和北京等省市，給中國鴨鵝養殖業造成嚴重經濟損失。經過病原分離和系統的實驗室診斷，證實該病病原為一種新型的坦布蘇病毒病，該病的發病率高達100%，死亡率為5% ～10%。2011年和2012年夏秋季，鵝坦布蘇病再次在江蘇等省大面積暴發，是2010年以來危害養鴨、鵝業最嚴重的疾病之一［1-3］。

鵝坦布蘇病毒是不分節段的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)。鵝坦布蘇病毒基因組大約11000 bp，編碼3個結構蛋白質:核衣殼蛋白質(C)、外膜蛋白質(PrM and M)和囊膜蛋白質(E)及7個非結構蛋白質(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5)［4］。囊膜蛋白質(E蛋白質)全長為500個氨基酸左右，相對分子質量約為54000，位于成熟病毒顆粒表面，構成病毒顆粒的突起。E蛋白質是黃病毒主要的結構蛋白質，在病毒吸附、與宿主細胞膜融合以及病毒組裝過程中具有重要作用。同時，E蛋白質也是黃病毒主要的抗原成分，含有多種抗原表位，可通過誘發中和抗體產生保護性免疫應答［5］。

研究結果表明黃病毒E蛋白質二級結構主要由β-折疊組成，在空間上形成3個不同的結構域(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ區)［6-7］。結構域Ⅰ位于E蛋白質單聚體中央，由120個左右氨基酸組成的3個不連續片段構成一個β桶狀中心結構，起到穩定E蛋白質二聚體的作用。結構域Ⅱ由2個不連續片段組成，折疊成指樣結構。該區域cd環富含甘氨酸且完全疏水，在幾乎所有的黃病毒屬病毒中均是保守的，在E蛋白質由二聚體向三聚體轉變的過程中插入胞膜，參與病毒與宿主細胞膜融合，被認為是病毒融合肽［8-9］。由此推測，坦布蘇病毒E蛋白質結構域Ⅰ和Ⅱ在病毒感染和致病過程中具有重要作用。

本研究試圖克隆并表達鵝坦布蘇病毒JS804株E蛋白質結構域Ⅰ和Ⅱ，并利用大腸桿菌表達系統獲得重組E蛋白質結構域Ⅰ和Ⅱ的大量表達，并通過Western-blot進行驗證，為進一步研究鵝坦布蘇病毒的生物學特性、免疫學功能和血清學檢測奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 質粒、菌株

含有鵝坦布蘇病毒JS804株全基因的質粒、pET28a原核表達載體，宿主菌DH5α、BL21(DE3)，E蛋白質陽性血清，均由江蘇省農業科學院獸醫研究所家禽重大疫病防控項目組保存。

1.2 主要試劑

瓊脂糖凝膠回收試劑盒、小量提取質粒試劑盒等購自Axygen公司;pMD18-T載體、T4DNA連接酶、Ex Taq酶、限制性內切酶、DNA marker等購自大連寶生物有限公司;FLAG抗體、堿性磷酸酯酶標記山羊抗小鼠ⅠgG、BCⅠP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒購自碧云天生物技術研究所;其他試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.3 E 蛋白質結構域Ⅰ和Ⅱ(E-Ⅰ/Ⅱ)基因的克隆

1.3.1 引物設計 根據GenBank中登錄的鵝坦布蘇病毒JS804株(登錄號:JF 895923)E基因序列，設計PCR擴增引物，其中上游引物為E-Ⅰ/Ⅱ-F:5'-GAATTCATGGACTACAAAGACGACGACGACAAATTCAGCTGTCTGGGGATGC-3'，劃線部分為引入的 EcoRⅠ酶切位點，斜體部分為引入的FLAG標簽序列。下 游 引 物 為 E-Ⅰ/Ⅱ-R:5'-GTCGACTCATTTGTCGTCGTCGTCTTTGTAGTCTTTCAGCTTCAAACCC TGC-3'，劃線部分為引入的SalⅠ酶切位點，斜體部分為引入的FLAG標簽序列。以上引物由南京金斯瑞生物有限公司合成，預期擴增片段大小為893 bp。

1.3.2 E蛋白質結構域Ⅰ和Ⅱ基因的PCR擴增以含有鵝坦布蘇病毒JS804株全基因的質粒為模板進行PCR擴增。PCR 反應體系為25.0 μl，其中雙蒸水 15.5 μl，10 × PCR buffer 2.5 μl，25.0 mmol/L MgCl21.5 μl，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μl，上、下游引物(25 pmol/μl)各 1.0 μl，模板 DNA 1.0 μl，Ex Taq(5 U/μl)0.5 μl。PCR 反應程序:94 ℃ 預變性 5 min;94 ℃變性30 s，52 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，30個循環;72℃延伸10 min。循環反應結束后，將擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對PCR產物進行膠回收。純化的PCR產物片段與pMD18-T克隆載體連接成重組質粒，轉化E.coli DH5α感受態細菌。經酶切鑒定后，挑選陽性克隆質粒送南京金斯瑞生物有限公司進行基因序列測定。測序結果在NCBⅠ進行在線比對分析。

1.4 重組表達質粒的構建與鑒定

將 pMD18-T-E-Ⅰ/ⅠⅠ和 pET28a 質粒分別用 EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切。用T4DNA連接酶將酶切后的E-Ⅰ/ⅠⅠ基因分別與 pET28a 載體連接，轉化 BL21(DE3)感受態細胞，構建重組表達載體。經酶切鑒定后，挑選陽性克隆質粒送南京金斯瑞生物有限公司進行基因序列測定與分析。

1.5 E蛋白質結構域Ⅰ和Ⅱ蛋白質的誘導表達與SDS-PAGE分析

分別取含pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠ重組質粒的陽性BL21(DE3)菌液，接種于 5 ml含有卡那霉素(100 μg/mL)的LB液體培養基中，37℃培養過夜。次日取 100 μl接種于 10 ml含有卡那霉素(100 μg/ml)的LB液體培養基中，37℃振蕩培養至OD600值達0.3 ～0.4，以終濃度1 mmol/L ⅠPTG 誘導表達，分別于誘導后4 h、6 h 取500 μl菌液，12000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用生理鹽水重懸后與4×蛋白質電泳上樣緩沖液混勻，沸水浴5 min，以pET28a空載體進行同樣的操作作為對照，進行SDS-PAGE蛋白質電泳觀察結果。

1.6 重組E蛋白質結構域Ⅰ和Ⅱ蛋白質在菌體中的分布

取5 ml 1 mmol/LⅠPTG誘導4 h的菌液，12000 r/min離心5 min，棄上清液，沉淀用3 ml菌體裂解液重懸，超聲波破碎15 min，12000 r/min離心5 min，分別取上清液和沉淀與4×蛋白質電泳上樣緩沖液混勻，沸水浴5 min，進行SDS-PAGE蛋白質電泳觀察結果，以確定表達蛋白質存在的位置。

1.7 重組蛋白質的Western-blot鑒定

重組蛋白質經12%SDS-PAGE分離后，采用濕法將蛋白質轉印至硝酸纖維膜(NC)膜上，采用70 V電壓，作用 1 h。5%BSA、37℃封閉 2 h，TBST(0.05%Tween-20)洗滌后分別加入FLAG標簽單抗和E蛋白質陽性血清并于4℃過夜。TBST(0.05%Tween-20)洗滌后加入堿性磷酸酶(AP)標記的羊抗鼠 ⅠgG于37℃孵育1 h。TBST(0.05%Tween-20)洗滌后按照BCⅠP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒說明書顯色。

2 結果

2.1 鵝坦布蘇病毒E蛋白質結構域Ⅰ和Ⅱ(E-Ⅰ/Ⅱ)基因的擴增

以含有鵝坦布蘇病毒JS804株全基因的質粒為模板，用所設計的特異性引物擴增E基因結構域Ⅰ和Ⅱ片段，結果擴增的片段大小約為900 bp左右，與預期大小相符(圖1)。

圖1 鵝坦布蘇病毒E基因結構域Ⅰ和Ⅱ片段PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification of domainsⅠ and Ⅱ of goose tembusu virus E gene

2.2 鵝坦布蘇病毒E蛋白質結構域Ⅰ和Ⅱ(E-Ⅰ/Ⅱ)重組表達質粒的構建

提取重組質粒 pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠ，經限制性內切酶EcoRⅠ和SalⅠ酶切后，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別得到2個片段，大小與預期相符(圖2)，測序結果表明E-Ⅰ/ⅠⅠ片段以正確方式分別插入pET28a載體中且序列正確。

2.3 鵝坦布蘇病毒E蛋白質結構域Ⅰ和Ⅱ蛋白質的誘導表達與SDS-PAGE分析

將鑒定為陽性的細菌進行ⅠPTG誘導表達，經SDS-PAGE檢測后發現，以1 mmol/LⅠPTG誘導時，pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠ在誘導后4 h出現目的條帶，大小約為37000的融合蛋白質，與預期蛋白質大小一致，在誘導6 h時表達量最高(圖3)。

2.4 重組鵝坦布蘇病毒E蛋白質結構域Ⅰ和Ⅱ蛋白質在菌體中的分布

圖2 重組質粒pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠ的酶切鑒定Fig.2 Ⅰdentification of recombinant plasmid pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠby enzyme digestion

圖3 pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠ重組蛋白質的 SDS-PAGE 檢測Fig.3 Analysis of pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠfusion protein by SDS-PAGE

將誘導表達6 h的細菌進行超聲波裂解，經SDS-PAGE電泳分析，結果發現 pET28a-E-Ⅰ/Ⅱ融合蛋白質以包涵體形式存在(圖4)。

2.5 重組鵝坦布蘇病毒E蛋白質結構域Ⅰ和Ⅱ蛋白質的Western-blot鑒定

Western-blot結果顯示，誘導后的全菌蛋白質在相對分子量約為37000的位置有與FLAG標簽單抗反應的特異條帶(圖5)，說明E-Ⅰ/Ⅱ成功與FLAG標簽進行了融合表達。

以鵝坦布蘇病毒E蛋白質陽性血清為一抗，用Western-blot對表達的重組蛋白質進行分析，結果顯示，在37000處有特異性條帶(圖6)，表明該重組蛋白質得到正確表達且具有良好的反應原性。

圖4 pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠ重組蛋白質在菌體中的分布Fig.4 Distribution of pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠfusion protein in recombinant E.coli

圖5 FLAG單克隆抗體鑒定pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠ融合蛋白質Fig.5 Western-blot identification of pET28a-E-Ⅰ/ⅠⅠfusion protein against FLAG McAb

圖6 E蛋白質陽性血清鑒定pET28a-E-Ⅰ/Ⅱ融合蛋白質Fig.6 Western-blot identification of pET28a-E-Ⅰ/Ⅱ fusion protein against positive serum for E protein

3 討論

由鵝坦布蘇病毒引起的疫病在中國屬于新發傳染病，可引起蛋鴨、種鵝死亡和產蛋下降，幾乎所有鴨、鵝場均遭受了巨大經濟損失，雖然該病已在中國南方大部分地區廣泛流行，但對病原的生物學特性、致病機理、流行規律尚未進行深入研究，這給本病的防控帶來一定困難。

黃病毒屬病毒通過E蛋白質與宿主細胞表面受體結合而吸附和感染宿主細胞。因此，E蛋白質與宿主細胞表面受體的相互作用是病毒對宿主細胞嗜性和病毒毒力的主要決定因素。硫酸乙酰肝素(HS)是廣泛存在于細胞表面的一類由二糖重復單位組成的多糖，表面具有大量負電荷具有包括介導病原體吸附等在內的多種生物學功能。研究結果表明黃病毒E蛋白質結構域Ⅰ和Ⅱ中帶有大量的正電荷Arg和Lys，可能有助于病毒與HS結合［10］。

本試驗選用pET-28a原核表達載體成功表達鵝坦布蘇病毒E蛋白質結構域Ⅰ和Ⅱ。表達的目的蛋白質雖以包涵體形式存在，但是通過簡單的包涵體變性和復性等純化步驟后即可獲得高表達量、單一的目的蛋白質，同時由于攜帶有FLAG標簽，其特異性較好，使用廣泛，使得Western-blot檢測更加簡便、可信，并利于后續試驗中的特異性檢測。

綜上所述，本研究實現了重組鵝坦布蘇病毒E蛋白質結構域Ⅰ和Ⅱ的原核表達，為研究囊膜蛋白質在鵝坦布蘇病毒細胞感染中的生物學功能奠定基礎。

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