2種培養基對碳青霉烯類藥物抗非發酵菌體外藥敏檢測結果的影響

金波+葉巖榮

摘 要 目的：評估低氨基酸培養基和MH培養基對碳青霉烯類藥物抗非發酵菌體外藥敏檢測結果的區別。方法：采用瓊脂稀釋法分別使用MH和低氨基酸培養基測定亞胺培南、美羅培南、帕尼培南等10種抗菌藥物對我院臨床分離60株銅綠假單胞菌和140株鮑曼不動桿菌的最低抑菌濃度（MIC），比較其結果的差異。結果：使用MH瓊脂作為藥敏培養基時，60株銅綠假單胞菌和140株鮑曼不動桿菌對亞胺培南、美羅培南和帕尼培南的敏感率分別為90%、85%和68.3%和15.7%、23.6%和15%；使用低氨基酸瓊脂作為藥敏培養基時，它們的敏感性分別上升到100%（P=0.272）、96.7%（P=0.053）、93.3%（P=0.001）和90.7%（P=0.001）、98.6%（P=0.001）和91.4%（P=0.001），其中銅綠假單胞菌對帕尼培南的敏感率上升有顯著差異，而鮑曼不動桿菌對三者的敏感率上升均有顯著差異。結論：我院分離的鮑曼不動桿菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥率較高。碳青霉烯類藥物對銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌的抗菌活性高于其它類抗菌藥物。低氨基酸培養基，由于其堿性氨基酸濃度降低至與人血清中相近的濃度，適宜用于帕尼培南體外敏感性測定。

關鍵詞 碳青霉烯類 非發酵菌 體外藥敏 低氨基酸培養基

中圖分類號：R446.5 文獻標識碼：B 文章編號：1006-1533（2014）11-0019-04

Evaluation of the susceptibility of clinical

non-fermentative isolates to carbapenems on two kinds of media

JIN Bo*， YE Yanrong**

（Department of Pharmaceutical Preparation， Zhongshan Hospital， Fudan University， Shanghai 200032， China）

ABSTRACT Objective： To evaluate the effects of low-amino-acid agar and Mueller-Hinton （MH） agar on the susceptibility of clinical non-fermentative isolates to three carbapenems. Methods： The activities of imipenem， meropenem， panipenem and so on were tested against 40 Pseudomonas aeruginosa and 160 Acinetobacter baumannii strains isolated from our hospital. The minimum inhibitory concentration （MIC） of each antimicrobial agent against these strains was determined by a standard agar dilution procedure on the MH and low-amino-acid agars， respectively. Results： The susceptibility of P. aeruginosa and A. baumannii to imipenem， meropenem， panipenem was 90%， 85%， 68.3% and 15.7%， 23.6% ， 15%， respectively when they were incubated on MH agar， however， their susceptibility was enhanced to 100% （P=0.272）， 96.7% （P=0.053）， 93.3% （P=0.001）and 90.7% （P=0.001）， 98.6% （P=0.001） and 91.4% （P=0.001） on low-amino-acid agar， respectively， which were statistically significant. Conclusion： Carbapenems had good antibacterial activity in vitro against P. aeruginosa and A. baumannii. Low concentrations of basic amino acid medium should be used in order to get consistent result between in vitro susceptibilities and clinical effect of panipenem against P. aeruginosa..

KEY WORDS carbapenems； non-fermentative isolates； in vitro susceptibilities； low-amino-acid agar

碳青霉烯類抗菌藥物于20世紀90年代初開始用于臨床，由于其對β內酰胺酶較強的穩定性，對幾乎所有的腸桿菌科細菌具強大的抗菌作用，是治療產超廣譜β內酰胺酶（ESBLs）、頭孢菌素酶（AmpC）等多重耐藥革蘭陰性桿菌包括某些非發酵菌所致感染的重要藥物[1]。但近年來隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類菌株、特別是非發酵菌耐藥菌株的不斷增加，給臨床治療帶來極大的困難，而采用不同的培養基測試它們的藥敏結果有不小差異[2]。為確切了解在我院目前碳青霉烯類與其它常用的抗菌藥物對銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌的體外抗菌活性，我們在MH培養基上分別對臨床分離的銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌檢測了最低抑菌濃度（MIC），并對在2種不同培養基上測試的三種碳青酶烯類抗菌藥物的抗菌活性進行了比較，為臨床正確評價不同培養基上測試的藥敏結果和合理選用抗菌藥物提供依據和參考。

1 材料和方法

1.1 菌株

收集我院2010年1-9月不同標本來源的臨床革蘭陰性非發酵分離株200株作為受試菌株，其中銅綠假單胞菌60株、鮑曼不動桿菌140株。所有分離株都由鳳凰全自動細菌鑒定藥敏儀（Phoenix System，美國BD）鑒定通過。質控菌株采用大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27953（購自上海市臨床檢驗質控中心）。

1.2 抗菌藥物

本研究所測試的10種抗菌藥物均為標準品（購自中國食品藥品檢定研究院）。

1.3 培養基

MH培養基（購自英國Oxoid）作為目前臨床微生物使用的常規藥敏培養基；Davis 基礎培養基（minimal agar Davis，購自美國BD）和酸 水解酪蛋白（ 購自美國Sigma）作為低氨基酸瓊脂培養基，其配制方法為每升Davis基礎培養基中加入4.5 g酸水解酪蛋白；哥倫比亞血平板（購自法國梅里埃）為細菌純化分離培養基。

1.4 藥敏試驗方法

MIC測定采用瓊脂稀釋法藥敏試驗[3]。受試菌株均在血平板上傳代1次，保證其純度及活力，挑取單個菌落接種于90 mm的血平板上，用接種環涂布于整個平板，置于含5% CO2的二氧化碳培養箱于35 ℃孵育18 h。試驗當日將生長的菌落懸浮于2 ml 0.85%滅菌生理鹽水中，制備濃度為0.5個麥氏單位的菌懸液。稀釋后使用多點接種儀將約1～2 ?l菌懸液點種在含有不同濃度抗菌藥物的平板上，不加抗菌藥物的平板作為陽性對照，細菌的最終接種濃度為104 CFU/點。所有平板置于含5% CO2的二氧化碳培養箱于35 ℃孵育18 h觀察結果。

1.5 結果判讀方法

肉眼觀察細菌生長結果，與陽性對照比較抑制80%以上細菌生長的最低藥物濃度作為該藥的MIC值[3]。

1.6 數據計算和分析

根據MIC值，采用Whonet 5.4藥敏統計分析軟件計算MIC50、MIC90、耐藥率、中敏率和敏感率，其中藥敏結果折點參考2012年版CLSI，M100-S22[4]，帕尼培南的判斷折點參考文獻[5]，頭孢哌酮/舒巴坦判斷折點參考頭孢哌酮[5]。

2 結果

2.1 在MH培養基上體外抗菌活性

10種抗菌藥物對銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌的體外抗菌活性見表1。

2.2 在低氨基酸培養基上的體外抗菌活性

低氨基酸培養基能提高碳青霉烯類的抗菌活性，3種碳青霉烯類藥物對銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌的體外抗菌活性見表2。使用卡方檢驗分析，銅綠假單胞菌對帕尼培南的敏感率顯著上升，P<0.05具有統計學意義；鮑曼不動桿菌對三種碳青霉烯類藥物的敏感率均顯著上升，P<0.05具有統計學意義。

3 討論

銅綠假單胞菌對碳青霉烯類的主要耐藥機制，包括產生外排泵、獲得編碼β-內酰胺酶的基因和外膜通透性降低等。OprD是銅綠假單胞菌外膜上堿性氨基酸的結合位點，能夠加速堿性氨基酸的擴散。由于碳青霉烯類在結構上與堿性氨基酸相似，因此OprD也是碳青霉烯類進入銅綠假單胞菌的通道。OprD缺失會主要導致這兩種細菌對亞胺培南耐藥，但對美羅培南敏感性的降低程度比較有限[6].

國外有研究表明降低MH瓊脂培養基中的基礎氨基酸濃度可以增強銅綠假單胞菌外膜D2孔蛋白通道運送碳青霉烯類抗菌藥的能力，有利于其進入細菌從而提高抗銅綠假單胞菌活性[6]。Fukuoka等[7]報道，帕尼培南和亞胺培南在人血清中抗假單胞菌的活性遠高于MH培養基，而在人血清中加入堿性氨基酸，其活性則會顯著降低。Muramatsu等[8]研究表明，帕尼培南、亞胺培南和美羅培南中帕尼培南的MIC受堿性氨基酸影響最大。蕭晨路等[9]研究發現低氨基酸培養基能夠增強碳青霉烯類尤其是帕尼培南的抗假單胞菌的活性，而目前臨床微生物實驗室通常采用的藥敏培養基MH會降低銅綠假單胞菌對帕尼培南的體外敏感性，本研究證實這一結果，其中帕尼培南的抗菌效果上升顯著，銅綠假單胞菌在低堿培養基中對帕尼培南的耐藥率及MIC50/MIC90分別為0%和（0.032/2）。本研究還發現鮑曼不動桿菌在低氨基酸的培養基中對碳青霉烯類藥物的敏感性也顯著上升，這與國外研究結果相差較大，是否和本院分離的鮑曼不動桿菌耐藥機制獨特性有關，需進一步研究證實原因。

綜上所述，由于目前臨床微生物實驗室通常采用的藥敏培養基MH中含有高濃度的堿性氨基酸，會對碳青霉烯類藥物，尤其是帕尼培南的體外藥敏檢測結果造成影響，因此可能需要根據測試細菌的種類對藥敏培養基中堿性氨基酸濃度進行調整。針對銅綠假單胞菌對帕尼培南的體外藥敏檢測，宜采用低濃度氨基酸培養基進行測定，這樣得到的結果更能符合人體內實際情況。

參考文獻

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[3] Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically[EB/OL]. [2013-10-10]. http：//ebookbrowsee.net/cl/clsi-m07-a8#.U0jDNeZWQoM.

[4] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing， Twenty-Second Informational Supplement[EB/OL]. [2013-10-10]. http：//antimicrobianos.com.ar/ATB/wp-content/uploads/2012/11/M100S22E.pdf.

[5] 黃瑤， 徐英春， 胡云建， 等. SENANIR監測中國15所教學醫院不發酵糖革蘭陰性桿菌對13種抗菌藥物的藥敏[J]. 中國感染與化療雜志， 2012， 12（4）： 268-275.

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[7] Fukuoka T， Ohya S， Narita T， et al. Activity of the carbapenem panipenem and role of the OprD （D2）protein in its diffusion through the Pseudomonas aeruginosa outer membrane[J]. Antimicrob Agents Chemother， 1993， 37（2）： 322-327.

[8] Murmatsu H， Horii T， Morita M， et al. Effect of basic amino acids on susceptibility to carbapenems in clinical Pseudomonas aeruginosa isolates[J]. Int J Med Microbiol， 2003， 293（2-3）： 191-197.

[9] 蕭晨路， 韓立中， 孫景勇， 等. 鮑曼不動桿菌及銅綠假單胞菌體外抗菌活性的分析及培養基的影響[J]. 檢驗醫學， 2011， 26 （9）： 582-585.

（收稿日期：2013-12-12）