HS-SPME-GC-MS分析石榴酒中易揮發(fā)性成分

李美萍，苗瀟瀟，張生萬(wàn)*

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

石榴系石榴科石榴屬，落葉灌木或小喬木，又名安石榴、丹若、金嬰、天漿等[1]，果實(shí)富含糖類、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2]，有“天下奇果，九州名果”的美譽(yù)。在我國(guó)已有兩千多年的栽培歷史[3]。而石榴酒是以石榴為原料經(jīng)破碎、榨汁、低溫發(fā)酵、陳釀老熟而成的色澤金黃、清澈透明、口味酸飴、果香濃郁、酒體醇厚[4-5]的低度果酒，備受人們青睞。

石榴酒易揮發(fā)成分是構(gòu)成和影響其風(fēng)味、質(zhì)量及典型性的主要因素。而石榴酒的成分復(fù)雜，對(duì)其組成分析時(shí)，需要進(jìn)行分離、富集。固相微萃取（solid phase micro-extraction，SPME）技術(shù)由于其突出的優(yōu)點(diǎn)成為目前國(guó)內(nèi)外使用較多的對(duì)樣品進(jìn)行分離富集方法之一，已在環(huán)境、食品、生化、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[6-8]，且頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用分析（head space-SPME-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GCMS）技術(shù)是一種被用于分析各種酒中易揮發(fā)成分的常用方法[9-12]。目前，對(duì)石榴的研究主要是對(duì)其種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)和利用[13-15]，而對(duì)其揮發(fā)性物質(zhì)的研究也多為對(duì)石榴果實(shí)、石榴皮及石榴籽等方面[16-18]，還未見對(duì)石榴酒揮發(fā)性成分的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以石榴酒為研究對(duì)象，重點(diǎn)對(duì)HS-SPME條件進(jìn)行選擇，優(yōu)化GC-MS分析條件，對(duì)石榴酒易揮發(fā)性成分進(jìn)行定性和定量分析，旨在建立石榴酒中易揮發(fā)性成分的HS-SPME-GC-MS分析方法，為石榴酒香氣特征研究、感官風(fēng)味評(píng)價(jià)以及產(chǎn)品質(zhì)量控制提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

精品原漿石榴酒（酒精度10% 2012年1月14日生產(chǎn)）西安丹若爾石榴酒業(yè)有限責(zé)任公司。

NaCl（分析純） 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、85 μm PA固相微萃取頭及萃取手柄美國(guó)Supelco公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)Agilent公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 頂空固相微萃取的分離富集方法

準(zhǔn)確移取8.0 mL酒樣置于20 mL頂空瓶中，再按0.30 g/mL的質(zhì)量濃度加入NaCl，然后用帶有橡膠隔墊的瓶蓋密封，放入集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，在45 ℃攪拌平衡30 min，然后將50/30 μm DVB/CAR/PDMS微萃取頭插入頂空瓶中距液面1 cm處，在45 ℃萃取50 min，待定性與定量分析。

1.2.2 GC-MS聯(lián)用分析條件

GC條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣He，流速1 mL/min；分流比20∶1；FFAP色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫條件：33 ℃保持3 min，12 ℃/min升至60 ℃，6 ℃/min升至140 ℃，10 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子電離能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 22～500；質(zhì)譜庫(kù)為NIST 05；溶劑延遲4.5 min；掃描模式為全掃描。

1.2.3 定性與定量分析方法

在1.2.2節(jié)GC-MS聯(lián)用分析條件下，將HS-SPME后的萃取頭插入GC進(jìn)樣口，在進(jìn)樣口250 ℃解吸4 min，隨后進(jìn)行色譜掃描，再對(duì)每一組分的質(zhì)譜圖進(jìn)行解析并與NIST 05質(zhì)譜庫(kù)對(duì)比，根據(jù)匹配度確定各易揮發(fā)性成分的結(jié)構(gòu)，同時(shí)采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量。

1.2.4 條件優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.4.1 單因素試驗(yàn)

選取對(duì)萃取效果有明顯影響的因素，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn),以物質(zhì)出峰數(shù)目和總峰面積為主要考察指標(biāo)，確定試驗(yàn)萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、85 μm PA）、萃取時(shí)間（20、30、40、50、60 min）、樣品用量（4.0、6.0、8.0、10.0 mL）、加鹽量（0.20、0.25、0.30、0.35 g/mL）、解吸時(shí)間（2、3、4、5 min）、平衡時(shí)間（10、20、30、40、50 min）、萃取溫度（30、35、40、45、50 ℃）條件。考察其中單一因素條件時(shí)，固定其他因素條件如下：準(zhǔn)確移取8.0 mL酒樣4份置于20 mL頂空瓶中，再按0.30 g/mL的質(zhì)量濃度加入NaCl，然后用帶有橡膠隔墊的瓶蓋密封，放入集熱式恒溫加熱磁力攪拌器中，于40 ℃條件下攪拌平衡20 min，然后將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入相應(yīng)頂空瓶距液面1 cm處，萃取吸附40 min、解吸3 min。

1.2.4.2 正交試驗(yàn)

對(duì)顯著影響萃取效果的各因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，綜合分析不同條件對(duì)揮發(fā)性成分分析的影響，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終確定HS-SPME-GC-MS分析石榴酒中易揮發(fā)性成分的分析條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 HS-SPME條件的選擇

2.1.1 萃取頭的選擇

表 1 不同萃取頭對(duì)萃取效果的影響Table 1 Effect of different SPME fiber types on the extraction Table 1 Effect of different SPME fiber types on the extraction指標(biāo) 萃取頭50/30 μm DVB/CAR/PDMS 65 μm PDMS/DVB 75 μm CAR/PDMS 85 μm PA峰個(gè)數(shù) 58 48 35 17總峰面積 5.98×108 3.61×108 3.55×108 4.93×107

從表1可知，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭所得峰總面積和峰個(gè)數(shù)均為最大，故本實(shí)驗(yàn)選擇該萃取頭用于石榴酒易揮發(fā)性成分的分離富集。

2.1.2 萃取時(shí)間的選擇

圖 1 萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響Fig.1 Effect of extraction times on the extraction

由圖1可知，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，萃取效果逐漸改善，但萃取時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)萃取的化合物數(shù)量及總峰面積最大，且萃取時(shí)間繼續(xù)增加其峰個(gè)數(shù)和總峰面積沒有明顯增大，所以選萃取時(shí)間為30 min。

2.1.3 樣品用量的選擇

由圖2可知，樣品用量為8.0 mL時(shí)，萃取的化合物相對(duì)數(shù)量較多，總峰面積也最大，故樣品用量選為8.0 mL。

圖 2 樣品用量對(duì)萃取效果的影響Fig.2 Effect of amounts of sample on the extraction

2.1.4 加鹽量的選擇

圖 3 加鹽量對(duì)萃取效果的影響Fig.3 Effect of amounts of added salt on the extraction

由圖3可知，隨著加鹽量增加，揮發(fā)性物質(zhì)的種類數(shù)和總峰面積都在增加，當(dāng)加鹽量為0.30 g/mL時(shí)，溶液達(dá)到飽和，再增大加鹽量，萃取效果沒有明顯改善，故加鹽量選為0.30 g/mL。

2.1.5 解吸時(shí)間的選擇

圖 4 解吸時(shí)間對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響Fig.4 Effect of desorption times on the extraction

由圖4可知，解吸時(shí)間為4 min時(shí)峰個(gè)數(shù)和總峰面積達(dá)到最大，再延長(zhǎng)解吸時(shí)間沒有明顯地變化，故解吸時(shí)間選為4 min。

2.1.6 平衡時(shí)間的選擇

由圖5可知，在30 min時(shí)，萃取得到的揮發(fā)性物質(zhì)種類數(shù)目和總峰面積相對(duì)較多，故平衡時(shí)間選為30 min。

圖 5 平衡時(shí)間對(duì)萃取效果的影響Fig.5 Effect of equilibrium times on the extraction

2.1.7 萃取溫度的選擇

圖 6 萃取溫度對(duì)萃取效果的影響Fig.6 Effect of extraction temperatures on the extraction

由圖6可知，萃取溫度在45 ℃時(shí)萃取的化合物相對(duì)數(shù)量較多，總峰面積也較大，故萃取溫度選為45 ℃。

2.1.8 正交試驗(yàn)

因解吸時(shí)間、平衡時(shí)間對(duì)萃取效果影響不明顯，而加鹽量為0.3 g/mL時(shí)，在萃取溫度為45 ℃時(shí)已達(dá)到飽和，故加鹽量選為0.30 g/mL。但萃取頭種類、萃取時(shí)間、萃取溫度及樣品用量相互之間對(duì)萃取效果有較大的影響，所以在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了如表2所示的四因素四水平的正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析如表3、4所示。

從表4可知，當(dāng)以峰面積為考察指標(biāo)時(shí)，各因素對(duì)萃取效果影響的大小順序?yàn)锳＞B＞C＞D，即萃取頭種類影響最大，萃取時(shí)間次之，較優(yōu)組合為A1B4C3D4；當(dāng)以總峰個(gè)數(shù)為考察指標(biāo)時(shí)，各因素對(duì)萃取效果影響的大小順序?yàn)锳＞C＞B＞D，即萃取頭種類＞萃取時(shí)間＞樣品用量＞萃取溫度，較優(yōu)組合為A1B4C3D3。由以上可知，萃取頭種類對(duì)峰個(gè)數(shù)和總峰面積影響最大，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭效果最好；萃取時(shí)間和樣品用量次之；萃取溫度對(duì)峰個(gè)數(shù)和總峰面積也有一定影響。綜合考慮，最終確定較優(yōu)組合為A1B4C3D3，即選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，加鹽量按0.30 g/mL的質(zhì)量濃度，在45℃萃取50 min。將最終確定的較優(yōu)組合與正交表中第3組試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較驗(yàn)證，較優(yōu)組合得到76個(gè)色譜峰，總峰面積為8.327×108，證明最終確定的較優(yōu)組合效果更好。

表 2 正交試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and coded levels used in orthogonal array design Table 2 Factors and coded levels used in orthogonal array design水平 因素A萃取頭 B萃取時(shí)間/min C樣品用量/mL D萃取溫度/℃1 50/30 μm DVB/CAR /PDM 20 4.0 35 2 65 μm PDMS/DVB 30 6.0 40 3 75 μm CAR/PDMS 40 8.0 45 4 85 μm PA 50 10.0 50表 3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Results of orthogonal array experiments試驗(yàn)號(hào) A B C D 空列 峰個(gè)數(shù) 總峰面積1 1 1 1 1 1 53 6.050×108 2 1 2 2 2 2 57 6.628×108 3 1 3 3 3 3 63 8.245×108 4 1 4 4 4 4 61 7.864×108 5 2 1 2 3 4 47 4.346×108 6 2 2 1 4 3 43 5.317×108 7 2 3 4 1 2 50 5.088×108 8 2 4 3 2 1 54 6.281×108 9 3 1 3 4 2 33 2.186×108 10 3 2 4 3 1 32 2.435×108 11 3 3 1 2 4 29 1.988×108 12 3 4 2 1 3 37 2.766×108 13 4 1 4 2 3 22 5.676×107 14 4 2 3 1 4 21 2.931×107 15 4 3 2 4 1 25 1.075×108 16 4 4 1 3 2 21 5.033×107表 4 正交試驗(yàn)對(duì)峰個(gè)數(shù)和總峰面積影響的極差分析Table 4 Range analysis for peak number and total peak area Table 4 Range analysis for peak number and total peak area指標(biāo) 峰個(gè)數(shù) 總峰面積A B C D A B C D k1 59 38 36 40 7.197×1083.287×1083.465×1083.549×108 k2 49 38 42 40 5.258×1083.668×1083.704×1083.866×108 k3 33 42 43 41 2.344×1084.099×1084.251×1083.882×108 k4 23 43 41 40 6.099×1074.354×1083.989×1084.111×108 R 36 5 7 1 6.587×1081.066×1087.865×1075.617×107較優(yōu)水平 A1 B4 C3 D3 A1 B4 C3 D4主次因素 A＞C＞B＞D A＞B＞C＞D

2.2 石榴酒易揮發(fā)成分分析

按1.2.1節(jié)HS-SPME分離富集方法所得樣品，在GC-MS聯(lián)用儀上，參照文獻(xiàn)[16-17]及結(jié)合本課題組對(duì)白酒分析的經(jīng)驗(yàn)[19]，對(duì)色譜分離條件進(jìn)行了選擇，發(fā)現(xiàn)按實(shí)驗(yàn)方法的條件，被測(cè)酒樣中易揮發(fā)成分能夠得到很好的分離。其總離子流色譜圖如圖7所示，解析結(jié)果見表5。

圖 7 石榴酒揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.7 Total ion current chromatogram of the volatile components of pomegranate wine

表 5 HS-SPME-GC-MS分析石榴酒揮發(fā)性成分結(jié)果T able 5 HS-SPME-GC-MS analytical results of the volatile T able 5 HS-SPME-GC-MS analytical results of the volatile composition of pomegranate wine ne序號(hào) 保留時(shí)間 化合物 相對(duì)分子質(zhì)量 匹配度/% 相對(duì)含量/%1 4.666 3-甲基-1-丙醇 74.07 81 0.75 2 5.008 乙酸-3-甲基正丁醇 130.10 90 0.31 3 5.481 1-丁醇 74.07 72 0.06 4 6.602 3-甲基正丁醇 88.09 83 19.37 5 7.032 己酸乙酯 144.12 95 1.76 6 7.445 苯乙烯 104.06 97 0.46 77.969 — — —0.22 8 8.021 3-羥基-2-丁酮 88 80 0.08 9 8.206 4-己烯酸乙酯 142.1 96 2.18 10 8.389 3-己烯酸乙酯 142.1 87 0.07 11 8.775 2-庚醇 116.12 78 0.15 12 9.246 2-羥基丙酸乙酯 118.06 78 0.44 13 9.429 1-己醇 102.1 83 0.64 14 10.046 3-己烯-1-醇 100.09 93 0.29 15 10.806 2-辛醇 130.14 80 0.05 16 11.093 辛酸乙酯 172.15 90 10.18 17 11.510 醋酸 60.02 91 2.57 18 11.830 糠醛 96.02 95 0.53 19 12.019 反-3,5-庚二烯-2-酮 110.07 90 0.18 20 12.099 2,4-己二烯酸乙酯* 140.08 96 0.22 21 12.234 2-乙基己醇 130.14 80 0.10 2212.458 — — —0.20 23 12.598 2,4-己二烯酸乙酯* 140.08 95 12.09 24 12.855 2-壬醇 144.15 72 0.40 25 13.910 苯甲醛 106.04 95 0.14 26 13.161 壬酸乙酯 186.29 96 0.06 27 13.282 2,3-丁二醇* 90.07 90 0.55 28 13.430 3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇 154.14 49 0.18 29 13.612 1-辛醇 130.14 91 0.12 30 13.874 2-甲基丙酸 88.05 72 0.13 31 14.046 2,3-丁二醇* 90.07 80 0.07 32 14.386 4-甲基-1-異丙基-3-環(huán)己烯醇 154.14 89 0.08 33 14.962 2-糠酸乙酯 140.05 90 0.08 34 15.214 癸酸乙酯 200.18 95 1.47 35 15.643 1-壬醇 144.15 86 0.14 36 15.720 苯甲酸乙酯 150.07 95 4.82 37 15.874 2-甲基丁酸 102.07 59 0.23 38 16.021 丁二酸二乙酯 174.09 91 1.07 39 16.233 9-癸烯酸乙酯 198.16 90 0.12 40 16.306 1-甲基-4-異丙醇-環(huán)己烯 154.14 90 0.35 41 16.726 2,2-二乙氧基-乙基苯 194.13 72 0.14 4217.067萘128.06810.05 43 17.253 2-甲基-5-丙烯基-環(huán)己酮 152.12 53 0.10 4417.316 — — —0.08 45 17.810 苯甲肟 151.06 83 0.28 46 18.025 苯乙酸乙酯 164.08 90 2.00 4718.208 — — —0.06 48 18.563 乙酸苯乙酯 164.08 83 0.86 49 19.154 己酸 116.08 83 0.72 50 19.643 苯甲醇 108.06 96 0.06 51 19.715 苯丙酸乙酯 178.1 97 0.11 5220.043 — — —0.05 53 20.159 苯乙醇 122.07 94 16.44 54 20.339 4-己烯酸 114.07 76 0.36 55 20.722 2-乙基己酸 144.12 86 0.07

續(xù)表5

采用HS-SPME-GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析石榴酒中的揮發(fā)性成分，只需少量的原料即可得到滿意的結(jié)果。由表5可見，石榴酒揮發(fā)性成分的色譜圖上共分離得到76 種化合物，確定結(jié)構(gòu)67 種（包括4 種異構(gòu)體），占石榴酒揮發(fā)性成分的99.39%。其中包括酯類化合物23 種（含量41.17%）、醇類化合物16 種（含量39.51%）、酸類化合物14 種（含量16.01%）、醛酮類化合物5 種（含量1.01%）以及酚類和其他化合物9 種（含量1.69%）。這些易揮發(fā)成分中相對(duì)含量在1%以上的主要是己酸乙酯、4-己烯酸乙酯、辛酸乙酯、2,4-己二烯酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、鄰苯二甲酸異丙酯辛酯、3-甲基正丁醇、苯乙醇、醋酸、辛酸、苯甲酸、山梨酸等。

3 討論與結(jié)論

3.1 在HS-SPME中，不同涂層的萃取頭所吸附的揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量各不相同，欲使固相微萃取纖維頭形成最大吸附效果，需要在頂空瓶?jī)?nèi)達(dá)到吸附與解吸的動(dòng)態(tài)平衡，同時(shí)樣品用量的多少、液面上部空間的大小、微萃取頭可承載量、加鹽量、樣品的平衡時(shí)間、萃取溫度等因素會(huì)直接影響揮發(fā)性成分的萃取效果。如果取樣量小，含量低的物質(zhì)檢測(cè)不到；取樣量太大，由于分子間的競(jìng)爭(zhēng)吸附以及與吸附劑親和力強(qiáng)、易揮發(fā)的物質(zhì)超載，導(dǎo)致被吸附的化合物種類反而會(huì)減少。對(duì)于在樣品中加入適量鹽，是由于大部分有機(jī)物因鹽析效應(yīng)會(huì)降低其在水中的溶解度，從而有利于有機(jī)物的溢出，增大溶液上部空間的壓強(qiáng)，促進(jìn)萃取頭吸附平衡正移動(dòng)，提高揮發(fā)性物質(zhì)的吸附量。而萃取溫度則能有效地影響萃取頭吸附揮發(fā)性物質(zhì)的種類數(shù)和總含量，隨著溫度的升高，一方面某些低溫條件下不揮發(fā)的半揮發(fā)性物質(zhì)會(huì)揮發(fā)，另一方面萃取頭上的揮發(fā)性物質(zhì)濃度也會(huì)增加，并在一定溫度條件下達(dá)到平衡，此時(shí)達(dá)到萃取頭的最大吸附量；但升高溫度也會(huì)增加萃取頭固有組分的解吸，從而降低萃取頭萃取分析的能力。同時(shí)，HS-SPME-GCMS方法分析石榴酒中易揮發(fā)性成分還受色譜柱、樣品在GC進(jìn)樣口的解吸時(shí)間、溫度、進(jìn)樣方式的影響。揮發(fā)性物質(zhì)在高溫條件下有利于解吸，但也可能會(huì)使一些揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，故需適宜的解吸時(shí)間；色譜柱和進(jìn)樣方式會(huì)影響到物質(zhì)的分離效果及峰形。通過本實(shí)驗(yàn)方案，得出利用HS-SPME-GC-MS分析石榴酒易揮發(fā)性成分的較優(yōu)條件：FFAP色譜柱、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、樣品用量8.0 mL/20.0 mL樣品瓶、加鹽量0.30 g/mL、萃取時(shí)間50 min、萃取溫度45 ℃、平衡時(shí)間30 min、解吸時(shí)間4 min。

3.2 在本實(shí)驗(yàn)選定的測(cè)定條件下，利用HS-SPME-GCMS方法分離鑒定石榴酒中易揮發(fā)性成分，共得到76 種化合物，確定結(jié)的67 種，其含量占總揮發(fā)性成分總量的99.39%。其中含量和種類最多的依次是酯類、醇類和酸類。石榴經(jīng)發(fā)酵釀酒后，酸類及酯類化合物含量增大，醛酮類化合物含量減少。而前者對(duì)石榴酒的香氣有較大的影響，如辛酸呈水果香氣，辛酸乙酯有清涼的水果香味[20]，己酸乙酯有強(qiáng)烈的果香和酒香香氣[20]，苯乙酸乙酯有顯著而甜蜜的玫瑰花香和似蜂蜜氣味，癸酸乙酯有椰子香味等。而苯乙醇是果酒發(fā)酵中酵母的代謝產(chǎn)物，質(zhì)量濃度合適就會(huì)給酒體帶來(lái)宜人的果香和花香[21]，石榴酒中這些揮發(fā)性成分賦予該酒酒香、果香，并與花香搭配協(xié)調(diào)，共同構(gòu)成其風(fēng)味。但是由于每種香氣物質(zhì)對(duì)石榴酒香氣的貢獻(xiàn)，除了與該物質(zhì)的含量有關(guān)外，還與該物質(zhì)的感官閾值及各物質(zhì)之間的相互影響有關(guān)。這些分析有待進(jìn)一步開展工作研究。

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