UPLC-MS-MS檢測飲料中的4-甲基咪唑及其同分異構體2-甲基咪唑

張 璐，孔祥虹，何 強，李建華，鄒 陽，李 瑩

（陜西出入境檢驗檢疫局，陜西 西安 710068）

4-甲基咪唑（4-(5-)-methylimidazole，4-Mel）和2-甲基咪唑（2-methylimidazole，2-Mel）是一類有機雜環化合物[1]。兩種物質互為同分異構體。其中4-Mel具有強烈的驚厥作用，能使動物（如兔、鼠、小雞等）產生超興奮狀態[2]。由于4-Mel具有抑制肝臟中血紅色素P450同功酶的作用，因此可能會導致肌肉無力從而引起痙攣[3]。4-Mel和2-Mel以亞硫酸銨為原料生產的焦糖色素副產物存在于食品中[4]。根據WHO規定，以色率2 000 EBC單位計，焦糖色素中4-Mel含量不得大于200 mg/kg[2]。美國國家毒理學規劃處（National Toxicology Program，NTP）組織和美國加州OEHHA（Office of Environmental Health Hazard Assessment）組織共同將4-Mel作為可致癌物質發出警告[5-6]。歐盟食品安全委員會建議以亞硫酸銨為原料生產的焦糖色素中4-Mel每日最大攝取量不超過200 mg/（kg·d）[7]。

目前檢測4-Mel和2-Mel的方法主要集中為高效液相色譜（high perfornance liquid chromatography，HPLC）法[8-12]、氣相色譜（gas chromatography）法[13-15]、高效液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LCMS）法[4,16-17]、氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）法[17-21]、二維色譜（two dimensional chromatography）法[22-23]、高效液相色譜-串聯質譜（highy performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS-MS）法[24-25]。高效液相色譜法需要采用雙（2-乙基己基）磷酸鹽提取后，庚烷磺酸鈉為離子對試劑為流動相進行檢測，前處理較為復雜。GC-MS法需要進行衍生化，操作較為繁瑣，檢測方法靈敏度不能滿足測定要求。二維液相色譜普及率較低。超高效液相色譜-串聯質譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MSMS）法前處理不需要衍生，操作簡便，選擇性靈敏度明顯優于其他檢測方法。

本研究應用固相萃取（solid phase extraction，SPE）技術結合UPLC-MS-MS法，建立了飲料中4-Mel和2-Mel的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所有飲料均為市購。

4-Mel和2-Mel標準品（純度＞98.5%） 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；4-甲基咪唑-d6（4-Mel-d6）（純度＞99.0%） 加拿大CDN公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 德國Merck KgaA公司；甲酸（色譜純） 安普有限公司；甲酸銨、氨水均為分析純；去離子水由Millipore 公司超純水器制得。

1.2 儀器與設備

ACQULITY Quattro Premier XE、ACQUITY UPLCHILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 mm）；OASIS?MCX固相萃取柱（3 mL，60 mg） 美國Waters公司；冷凍離心機 美國Sigma公司；氮吹儀美國Turbovap公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

標準儲備液配制：分別準確稱取10 mg 4-Mel和2-Mel標準品于10 mL棕色容量瓶，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1.0 mg/mL的標準溶液，于－20 ℃條件下保存。

同位素內標標準儲備溶液：準確稱取4-Mel-d6標準品于10 mL棕色容量瓶，用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1.0 mg/mL的標準溶液，于－20 ℃條件下保存。

標準工作溶液的配制：分別取上述儲備液0.025 mL于棕色容量瓶中，用乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液（9∶1，V/V）定容至25 mL，配制成1.0 μg/mL的混合中間標準工作溶液。使用前用乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液（9∶1，V/V）稀釋成9.0、15.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL系列質量濃度的混合標準溶液，其中4-Mel-d6質量濃度為60.0 ng/mL。

1.3.2 樣品處理

準確稱取3.0 g飲料樣品于15 mL具塞離心管中，加入1.0 mg/mL的4-Mel-d660 mL用水稀釋至10 mL，渦旋1 min。4 500 r/min離心5 min，待凈化。

凈化前，首先將OASISMCX固相萃取柱依次用3 mL甲醇，5 mL水活化，將上清液試樣全部轉移到已活化好的固相萃取柱上，流速控制為1 mL/min，待試樣溶液流盡后，用5 mL 2%甲酸溶液依次淋洗，再用9 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫，洗脫液用干燥氮氣氮吹至近干，用1 mL乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液（9∶1，V/V）定容，過0.22 mm有機濾膜后，進行UPLC-MS-MS檢測。

1.3.3 UPLC-MS-MS條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLCHILIC色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 mm）；柱溫：40 ℃；流動相：乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液（9∶1，V/V）等度洗脫；流速：0.3 mL/min；進樣量：2.0 mL。

1.3.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）；離子化方式：正離子模式（ESI+）；檢測模式：多反應監測（multi-reactions monitoring，MRM）；離子源電壓：2.9 kV；離子源溫度：115 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣（N2）：600 L/h；錐孔氣（N2）：50 L/h；碰撞氣為氬氣；其他質譜參數見表1。

注：*.定量離子。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

由于4-Mel和2-Mel為同分異構體，具有相同的分子質量和離子碎片，因此在質譜上無法分離。這就需要利用液相實現對這兩種化合物的分離。實驗中考察了ACQUITY BEH amide、ACQUITY BEH shield RP 18和ACQUITY BEH HILIC等不同色譜柱的分離情況。由圖1可知，在ACQUITY BEH amide上目標化合物不能分離，在ACQUITY BEH shield RP 18盡管目標化合物得到分離，但分離效果較差，而在ACQUITY BEH HILIC可不僅實現完全分離，且峰形良好。

圖 1 4-Mel和2-Mel在不同色譜柱上的保留色譜圖Fig.1 Chromatograms of 4-Mel and 2-Mel on different columns

實驗中考察了甲醇、乙腈作為流動相的有機相時的化合物的響應情況，結果表明當乙腈為有機相時，化合物的響應更高且噪音更低。因此選擇乙腈作為有機相。實驗中考察了目標化合物在乙腈-水，乙腈-0.1%的甲酸溶液，乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液體系中的分離情況。結果表明，在乙腈-水、乙腈-0.1%的甲酸溶液中目標化合物得不到有效的分離。而在乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液體系中目標無法實現完全分離和無可實現分離。同時，乙腈與5 mmol/L甲酸銨溶液的比例也影響目標化合物的分離情況。當乙腈-5 mmol/L甲酸銨溶液比例為7∶3（V/V）、8∶2（V/V）時，4-Mel和2-Mel均分離不完全，而當兩者比例達到9∶1（V/V）時，4-Mel和2-Mel不僅達到完全分離而且峰形良好，典型的果汁飲料基質加標色譜圖見圖2。

圖 2 果汁基質標準的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of juice matrix standard

2.2 固相萃取柱選擇

考察了Waters OASISHLB、Aglient Bond Elut C18和Waters OASISMCX對樣品的凈化效果和回收率。采用50 ng/mL的4-Mel和2-Mel標準溶液作為回收率實驗研究。結果表明，在Waters OASISHLB柱上目標化合物沒有保留。在Aglient Bond Elut C18柱上，4-Mel回收率為158.2%而2-Mel回收率為26.2%。在Waters OASISMCX柱上4-Mel和2-Mel的回收率分別為113.2%和107.9%，凈化效果良好。這是由于咪唑環的pKa為14.52，呈弱堿性，具有陽離子交換功能，故選擇具有強陽離子交換作用的反相吸附劑的固相萃取柱進行選擇性吸附，能夠更好的對目標化合物進行富集。因此選擇Waters OASISMCX（3 mL，60 mg）柱為凈化柱。

2.3 固相萃取柱條件優化

分別考察了不同水平梯度的氨水-甲醇溶液對目標化合物的洗脫能力，當氨水低于4%時，4-Mel回收率低于85%，當氨水高于5%時，4-Mel和2-Mel回收率均低于90%。當氨水-甲醇溶液中氨水為5%時，目標化合物回收率為105%和107%。因此選擇5%氨水-甲醇溶液作為洗脫溶液（圖3A）。同時考察了不同體積的5%氨水-甲醇溶液的洗脫能力，使用7 mL的5%氨水-甲醇洗脫回收率可達到95%以上，9 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫回收率可達100%以上（圖3B），故選擇9 mL 5%氨水-甲醇溶液為洗脫溶液。

2.4 方法的線性范圍、回收率、精密度

表 2 4-Mel和2-Mel的線性方程、相關系數和檢出限Table 2 Linear equations, correlation coefficients and limits of Table 2 Linear equations, correlation coefficients and limits of detection of 4-Mel and 2-Mel l目標化合物 線性方程 線性范圍/（ng/mL）相關系數（R2）定量限/（μg/kg）4-Mel y=19.433x＋94.563 9～500 0.999 5 3.0 2-Mel y=120.06x＋693.21 9～500 0.999 8 3.0

為了消除樣品基質效應，實驗中采用了內標法進行校正。將標準工作溶液逐級稀釋得到質量濃度為9.0、15.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL系列的混合標準溶液，其中4-Mel-d6質量濃度為60.0 ng/mL。按優化條件通過UPLC-MS-MS檢測，4-Mel和2-Mel的相關系數（R2）均大于0.99（表2）。在樣品中加入低質量濃度4-Mel和2-Mel混合標準溶液（加入量9.0 ng）重復測定6 份樣品，以信噪比大于10倍確定定量限（LOQ）為3.0 mg/kg。對不含焦糖色飲料、焦糖色飲料及咖啡進行四水平五平行的加標回收率測定，在不含焦糖色的飲料中的4-Mel和2-Mel的平均回收率分別為93.1%和90.1%。在含焦糖色的飲料中4-Mel和2-Mel的平均回收率分別為106.1%和90.1%。在咖啡中4-Mel和2-Mel的平均回收率分別為97.0%和104.3%。相對標準偏差均小于6.7%（表3）。

n=5）=5 Table 3 Average recoveries and precision obtained in spiked beverage,表 3 不同基質中4-Mel和2-Mel的加標回收率和精密度（Table 3 Average recoveries and precision obtained in spiked beverage,coca and coffee samples by the developed method (n = 5) = 5)樣品 樣品中含量/（μg/kg）目標化合物加標量/（μg/kg）回收率/%相對標準偏差/%軟飲料4-Mel 3.0 76.0 6.5 25.0 87.1 6.7 50.0 101.1 5.5 75.0 108.5 3.0 2-Mel 3.0 67.5 5.2 25.0 87.8 4.2 50.0 107.9 2.1 75.0 96.8 1.8可樂142.9 4-Mel 25.0 103.8 3.4 50.0 109.8 2.5 75.0 104.5 2.8 2-Mel 25.0 93.2 4.2 50.0 105.8 4.1 75.0 114.0 2.7咖啡34.4 4-Mel 25.0 101.4 1.8 50.0 87.2 1.7 75.0 102.5 2.0 6.8 2-Mel 25.0 97.7 2.1 50.0 96.7 2.8 75.0 108.1 3.3

2.5 實際樣品測定

按本實驗建立的方法對市售的49 批軟飲料、24 批焦糖色飲料（標簽顯示：添加以亞硫酸銨為原料生產的焦糖色素）、5 批咖啡飲料、5 批功能性飲料中4-Mel和2-Mel的含量進行調查。結果發現，在49 批軟飲料中檢出有12 批含有4-Mel，含量在1.2～30.1 mg/kg之間，5 批還有2-Mel含量在1.5～7.6 mg/kg之間；在24 批焦糖色飲料中檢出4-Mel含量在16.5～102.3 mg/kg之間；5 批咖啡飲料中4-Mel含量在8.6～37.2 mg/kg之間，2-Mel含量在2.9～7.9 mg/kg之間；5 批功能性飲料中未檢出含有4-Mel和2-Mel。結果表明，目前以亞硫酸銨為原料生產的焦糖色素仍然在普遍應用。

3 結 論

建立了水溶解樣品、OASISMCX固相萃取柱凈化、UPLC-MS-MS法檢測飲料中4-Mel及其同分異構體2-Mel的檢測方法。在優化條件下，4-Mel和2-Mel得到快速檢測，檢出限可達3.0 mg/kg。該方法快速、簡單、靈敏度高、穩定性好，能很好的應用于實際飲料中4-Mel和2-Mel的日常檢測。

[1]SCHLEE C, MARKOVA M, SCHRANK J, et al. Determination of 2-methylimidazole, 4-methylimidazole and 2-acetyl-4-(1,2,3,4-tetrahydroxybutyl) imidazole in caramel colours and cola using LC/MS/MS[J]. Journal of Chromatography B, 2013, 927: 223-226.

[2]陳洪興, 戴軍, 陳尚衛, 等. 高效液相色譜法測定焦糖色素中的4-甲基咪唑[J]. 中國調味品, 2006, 31(6): 53-56.

[3]CUNHA S C, BARRADO A I, FARIA M A, et al. Assessment of 4-(5-) methylimidazole in soft drinks and dark beer[J]. Journal of Food Composition and Analysis, 2011, 24: 609-614.

[4]BONVOJ K, JITKA M, VLASTIMIL K. Reversed-phase highperformance liquid chromatographic/mass spectrometric method for separation of 4-methylimidazole and 2-acetyl-4-(1,2,3,4-tetrahydroxybutyl) imidazole at pg levels[J]. Analytica Chimica Acta,2003, 477: 49-58.

[5]National Toxicology Program. Toxicology and carcinogenesis studies of 4-methylimidazole (CAS No. 822-36-6) in F344/N rats and B6C3F1 mice (Feed Studies)[M]. NTP Technical Report Series No.535, NIH Publication No. 07–4471. Research Triangle Park, NC: U.S.Department of Health and Human Service, 2007.

[6]OEHHA (Office of Environmental Health Assessment). Notice of intent to list 4-methylimidazole[S/OL]. http://oehha.ca.gov/prop65/crnr_notices/admin_listing/intent_to_list/noilpkg 32. html. Accessed 12.5.31, 2011.

[7]European Food Safety Authority (EFSA)[S/OL]. 2011. http://www.efsa.europa.eu/en/efsajournal/pub/2004.htm. Accessed 12. 7. 24, 2001.

[8]肖義夫, 廖百森. 高效液相色譜法測定焦糖色素中4-甲基咪唑[J]. 現代預防醫學, 2005, 32(3): 249-250.

[9]COFFEY J S, NURSTEN H E, AMES J M, et al. A liquid chromatographic method for the estimation of class Ⅲ caramel added to foods[J]. Food Chemistry, 1997, 58(3): 259-267.

[10]KARANGWA E, Jr, MITCHELL G E, TUCKER R E. Highperformance liquid chromatographic determination of 4-methylimidazole in sheep plasma and in ammoniated tall fescue hay[J]. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, 1990, 532: 105-113.

[11]MOON J K, SHIBAMOTO T. Formation of carcinogenic 4(5)-methylimidazole in maillard reaction systems[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59: 615-618.

[12]LEE K G, JANG H, SHIBAMOTO T. Formation of carcinogenic 4(5)-methylimidazole in caramel model systems: a role of sulphite[J].Food Chemistry, 2013, 136: 1165-1168.

[13]郭小莉, 陳敏, 張世湘, 等. 毛細管氣相色譜法測定焦糖色素中的4-甲基咪唑[J]. 食品科學, 2005, 26(2): 169-171.

[14]李繼民, 王彥吉, 鄒寧, 等. 毛細管氣相色譜法測定醬油中4-甲基咪唑的含量[J]. 中國法醫學雜志, 2007(3): 151-153.

[15]郭小莉, 陳敏, 胡錦榮, 等. 氣相色譜法測定醬油中的4-甲基咪唑[J].食品工業科技, 2004, 25(7): 125-127.

[16]BORIVOJ K, JITKA M, LEA L, et al. Solid-phase extraction of 4(5)-methylimidazole (4Mel) and 2-acetyl-4(5)-(1,2,3,4-tetrahydroxybutyl)-imidazole (THI) from foods and beverages with subsequent liquid chromatographic-electrospray mass spectrometric quantification[J]. Journal of Separation Science, 2006, 29: 378-384.

[17]LOJKOVA L, KLEJDUS B, MORAVCOVA J, et al. Supercritical fluid extraction (SFE) of 4(5)-methylimidazole (4-Mel) and 2-acetyl-4(5)-(1,2,3,4)-tetrahydroxybutyl-imidazole (THI) from ground-coffee with high-performance liquid chromatographic-electrospray mass spectrometric quantification (HPLC/ESI-MS)[J]. Food Additives and Contaminants, 2006, 23: 963-973.

[18]FERNANDES J O, FERREIRA M A. Gas chromatographic-mass spectrometric determination of 4-(5)methylimidazole in ammonia caramel colour using ion-pair extraction and derivatization with isobutylchloroformate[J]. Journal of Chromatography A, 1997, 786: 299-308.

[19]林曉珊, 杭義萍, 吳惠勤, 等. 氣相色譜-串聯質譜法測定焦糖色素中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑[J]. 分析試驗室, 2011, 30(11): 85-88.

[20]林曉珊. 氣相色譜-串聯質譜技術在調味品有害物質分析中的應用研究[D]. 廣州: 華南理工大學, 2011.

[21]CASAL S, FERNANDES J O, OLIVERIA M B P P, et al.Gas chromatograph-mass spectrometric quantification of 4-(5-)-methylimidazole in roasted coffee after ion-pair extraction[J].Journal of Chromatography A, 2002, 976: 285-291.

[22]MORETTON C, CRETIER G, NIGAY H, et al. Heart-cutting twodimensional liquid chromatography methods for quantification of 2-acetyl-4-(1,2,3,4-tetrahydroxybutyl)imidazole in class Ⅲ caramel colours[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1198/1199: 73-79.

[23]MORETTON C, CRETIER G, NIGAY H, et al. Quantification of 4-methylimidazole in class Ⅲ and Ⅳ caramel colors: validation of a new method based on heart-cutting two-dimensional liquid chromatography (LC-LC)[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59: 3544-3550.

[24]WANG Jinyuan, SCHNUTE W C. Simultaneous quantitation of 2-acetyl-4-tetrahydroxybutylimidazole, 2- and 4-methylimidazoles,and 5-hydroxymethylfurfural in beverages by ultrahigh-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60: 917-921.

[25]Y A M A G U C H I H, M A S U D A T. D e t e r m i n a t i o n o f 4(5)-methylimidazole in soy sauce and other foods by LC-MS/MS after solid-phase extraction[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59: 9770-9775.