高效液相色譜法測定辣椒粉中羅丹明B的測量不確定度評估

牛 華，牛之瑞*，馮 雷，魯燕驊，馬雪濤，譚建林，張學忠，俸金梅

（云南省產品質量監督檢驗研究院，云南 昆明 650223）

羅丹明B又稱玫瑰紅B，或堿性玫瑰精，俗稱花粉紅，以氧蒽為母體，具有特殊結構及熒光特性。經動物試驗發現，其具有高毒、高殘留和致癌、致畸、致突變等特點，歐美、日本等國家地區已明令禁止該類物質用于食品加工過程中，2008年我國衛生部將羅丹明B列入《食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單（第一批）》明令禁止在食品中添加[1]。

一切測量結果都不可避免地具有不確定度。測量不確定度是對測量結果的正確性或準確度的“可疑程度”的定量表征，是說明測量質量的極其重要的指標。我國已經出臺文件對校準實驗室測量不確定度的評估做出了要求，但目前許多實驗室仍未在檢測報告中提供測量結果的不確定度[2]。

我國現行的檢測食品中羅丹明B檢測標準只有SN/T 2430—2010《進出口食品中羅丹明B的檢測方法》，采用該方法對辣椒粉中的羅丹明B進行測定，并評估不確定度，以期找出影響檢測結果的因素，為實驗室類似測量不確定度評定工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒粉 市售；羅丹明B標準品（批號：212041286，純度為97%） 美國ACCU Stand公司；乙腈、甲醇色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UFLC-XR高效液相色譜（配熒光檢測器）、LabSlution工作站 日本Shimadzu公司；凝膠滲透色譜自動凈化儀（gel permeation chromatography，GPC）德國LC-Teach公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱取適量羅丹明B標準品0.001 0 g，用甲醇配制成100 μg/mL的標準儲備液。此溶液在0～4 ℃避光保存。以甲醇配制成相當于100 g/L的標準中間液，再以空白基質溶液稀釋成0.5、2.0、4.0 μg/L，供高效液相色譜測定。

1.3.2 樣品的制備[3]

稱取2 g（精確到0.000 1 g）辣椒粉樣品于25 mL容量瓶中，準確加入20 mL 乙酸乙酯-環己烷溶液（1∶1），于旋渦混合器上混合提取2 min，再超聲提取15 min后，定容至25 mL，取上清液過0.22 μm微孔濾膜后做待凈化液。

取出10 mL待凈化液于凝膠滲透色譜進樣瓶，用于凝膠滲透色譜凈化（凝膠滲透色譜實際進樣量為5 mL），收集洗脫液（相當于定容至2 mL后，取出1.5 mL），氮吹至近干，殘渣用1.0 mL甲醇溶解后，過0.22 μm微孔濾膜，供高效液相色譜測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為Alltima ODS（150 mm×3.0 mm，4.6 m），柱溫40 ℃；進樣量10 μL；流動相：溶劑A為水，溶劑B為乙腈；流量1.0 mL/min；激發波長550 nm，發射波長580 nm；梯度洗脫條件見表1。

表 1 色譜梯度洗脫條件Table 1 Gradient chromatographic conditions

1.4 數學模型的建立與結果計算

用外標法計算辣椒粉中羅丹明B的含量，其數學模型：

式中：X為辣椒粉樣品中羅丹明B的含量/（μg/L）；C為由標準曲線得到的樣液中羅丹明B的質量濃度/（μg/L）；C0為由標準曲線得到的空白實驗中羅丹明B的質量濃度/（μg/L）；V為辣椒粉樣品的定容體積/mL；m為最終樣液所代表的試樣質量/g。

2 結果與分析

2.1 標準品溶液配制過程引入的不確定度[4-8]

標準溶液稀釋過程中影響不確定度因素見表2。

2.1.1 標準品引入的不確定度

羅丹明B標準品證書上標稱的純度標示為97%，由標準品純度引入的不確定度為：

式中：Urel為相對不確定度；Cs為標準品的純度；std表示標準溶液配制過程。

2.1.2 天平誤差引入的不確定度

天平允許的最大誤差為±0.01 mg，稱取羅丹明B標準品1.00 mg，取矩形分布，引入相對標準不確定度為：

2.1.3 稀釋標準品引入的不確定度

稀釋標準品時，使用移液器移取10 μL標準儲備液于10 mL容量瓶中配制成相當于100 μg/L的標準中間液（Cm），移液器的允許誤差是8.0%，引入的相對標準不確定度為：

2.1.4 標準物質引入的總不確定度

上述各因素互不相關，因此，由羅丹明B標準溶液配制所產生的不確定度為：

2.2 最小二乘法擬合標準曲線求樣品質量濃度時產生的不確定度[9-13]

采用3個水平的羅丹明B標準溶液，用高效液相色譜測定1次，得到相應的峰面積，用最小二乘法進行擬合，得到擬合方程y=aC＋b，以及相關系數r（表3）。以擬合的標準曲線為定量標準，對樣品進行了4次測定，結果見表4。最小二乘法擬合標準曲線時引入不確定度結果見表5。

表 2 標準溶液稀釋過程中的不確定度Table 2 Uncertainty during standard solution dilution

表 3 線性回歸測定結果及擬合方程Table 3 Linear regression and fitted equation

表 4 樣品平行測定樣品的質量濃度（C0）測量結果Table 4 Results of parallel measurements

由標準曲線求質量濃度時的標準不確定度由式（6）計算：

式中：a為工作曲線的斜率；p為樣品平行測定的次數；m為標準溶液重復測定的次數；n為所配標準溶液個數；Sy/c為工作曲線的標準偏差；Sc/c為Cij各點的值與之差的總和；Yij為各質量濃度點測定響應值；Yi為線性方程計算響應值；C0為樣品平均質量濃度。

相對不確定度：

表 5 最小二乘法擬合標準曲線時引入不確定度Table 5 Uncertainty resulting from least square curve fittingTable 5 Uncertainty resulting from least square curve fitting

2.3 由樣品制備所引入的不確定度[14-21]

2.3.1 天平引入的不確定度

天平校準允許的最大誤差為±0.000 1 g，稱取辣椒粉2 g，取矩形分布，引入的相對標準不確定度為：

2.3.2 移液管引入的不確定度

使用25 mL（V1）移液管（A級）允許的最大誤差為±0.030 mL，取矩形分布，由樣品定容體積引入對標準的不確定度：

2.3.3 定容引入的不確定度

凈化完畢后，經氮氣吹干的樣品進行定容，使用1 mL（V2）移液管，其允許的最大誤差為0.007 mL，取矩形分布，引入的相對標準不確定度。

2.3.4 凝膠滲透色譜凈化過程回收率產生的不確定度

凝膠滲透色譜凈化過程回收率所產生的不確定度U（CR）由3次回收率測量平均值的標準偏差S（CR）計算所得（表6）：

為了確定回收率是否計入羅丹明B質量分數的計算中，應對平均回收率進行顯著性檢驗：

當t大于雙邊臨界值t（95，2）=4.3時，則回收率R有顯著性差異，回收率應用以修正結果；相反，則不必使用。

表 6 羅丹明B顯著性檢驗Table 6 Significance test of rhodamine B

表 6 羅丹明B顯著性檢驗Table 6 Significance test of rhodamine B

/% S（CR）/%U（CR）/% Urel（CR）/% t 顯著性差異58.1 5.60 3.23 5.56 1.30 不顯著

2.3.5 由樣品制備過程引入的總不確定度

上述各因素互不相關，因此，樣品的前處理過程的不確定度為：

2.4 測量不確定度的評定與報告

2.4.1 合成標準不確定度

2.4.2 相對擴展不確定度

95%置信水平下，取K=2，則：

2.4.3 擴展不確定度

2.4.4 結果表示

用高效液相色譜法測定辣椒粉中的羅丹明B，結果為：

3 結 論

通過對各檢測環節不確定度的評估發現，不確定度主要來自由樣品制備的過程中，而制備過程中則以凝膠滲透色譜凈化過程回收率的不確定度影響最大。所以，整個檢測過程的不確定度控制應以控制凝膠滲透色譜凈化過程回收率的穩定性為關鍵，來保障檢測結果的準確性。

[1]全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治領導小組. 食品中可能違法添加的非食用物質和易濫用的食品添加劑品種名單(第一批)[EB/OL]. (2008-12-12). http://www.jswst.gov.cn/gb/jsswst/zxgz/sptjj/userobject1ai21520.html.

[2]中國合格評定國家認可委員會. CNAS-CL07: 2011 測量不確定度的要求[S]. 北京: 中國標準出版社, 2011.

[3]國家質量監督檢驗檢疫總局. SN/T 2430—2010 進出口食品中羅丹明B的檢測方法[S]. 北京: 中國標準出版社, 2010.

[4]全國法制計量技術委員會. JJF 1059—1999 測量不確定度評定與表示[S]. 北京: 中國計量出版社, 1999.

[5]國家質量監督檢驗檢疫總局. JJG 196—2006 常用玻璃量器檢定規程[S]. 北京: 中國計量出版社, 2007.

[6]國家質量監督檢驗檢疫總局. JJG 646—2006 移液器檢定規程[S].北京: 中國計量出版社, 2007.

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