高效液相色譜法測定糜子中酚酸類化合物

鹿 茸，田 琴，孫 楠，喬治軍，張麗珍,*，牛 偉，單 璐，冀佩雙

（1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西省農業科學院農作物品種資源研究所，農業部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室山西 太原 030006；3.山西省農業科學院，山西 太原 030006）

糜子（PanicummiliaceumL.）屬禾本科（Gramineae）黍屬（Panicum L.），又稱黍、稷和穄，屬特色小雜糧[1]。起源于中國黃河流域的 黃土高原地區，具有耐鹽堿、耐冷、耐旱、耐貧瘠的特點，是干旱、半干旱地區主要的糧食作物，也是我國主要的制米作物[2]。糜子果實為穎果，脫殼后稱為糜米。隨著人民生活水平不斷提高，業界對全谷物食品關注度增加，作物品質越來越受到人們關注，小雜糧的育種栽培及功能成分的研究也得以快速發展。流行病學研究表明增加糜子及其加工產品的攝入量可以降低一些慢性病的風險，如血液中膽固醇[3]、心血管疾病[4]、Ⅱ型糖尿病[5]和肝損傷[6]。因此進一步探明糜子中對健康起促進作用的物質有著重要的意義。

植物多酚是指分子結構中有若干個酚羥基的植物成分的總稱[7-8]，其苯環上的羥基極易失去電子，可以作為良好的電子供體，具有抗氧化功能。植物多酚廣泛存在于植物的皮、根、葉和果實中，其含量僅次于纖維素、半纖維素以及木質素[9]。近年來植物多酚的研究成為植物代謝產物研究的熱點之一，但有關的研究多集中在水果[10-12]、蔬菜以及茶葉中[13]。研究發現谷物中含有多種酚酸類物質[14]，如阿魏酸[8,15-18]、香豆酸[19]等。谷物中酚酸類物質的種類與含量和果蔬相當[7-8,20]，某些活性物質含量甚至要高于果蔬。張莉等[21]研究表明添加麩皮生成的食醋中的總多酚和總抗氧化能力均優于未添加麩皮的食醋。臧盛等[22]發現不同品種糜子間多酚含量差異較大。本實驗針對糜子麩皮和糜米中的多酚物質，采用高效液相色譜法分析其酚酸成分和含量，為拓寬糜子麩皮的利用價值及其為麩皮用于天然抗氧化劑的開發提供依據，為培育與選用高生理活性物質含量的糜米谷物食品加工原料提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糜子樣品（赤黍2號、粘豐7號、齊黍1號、粘豐5號、白糜子、黃糜子、赤糜2號）均由山西省農業科學院農作物品種資源研究所提供，樣品保存于該所的作物種質資源中期貯存庫，2012年產于山西。

沒食子酸（批號：SLBC5726V，純度≥98.5%）、綠原酸（批號：SLBD3109V，純度≥95%）、丁香酸（批號：BCBB6440V，純度≥95%）、香草酸（批號：BCBF7869V，純度≥97.0%，色譜純）、p-香豆酸（批號：91M1197V，純度≥98.0%，色譜純）、阿魏酸（批號：STBB8393V，純度≥99%，色譜純） 西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；福林-酚 北京索萊寶科技有限公司；乙腈（色譜純） 天津市四友精細化學品有限公司；95%乙醇 河北中泰藥械有限公司；Na2CO3天津鵬達化學試劑有限公司；三氟酸（分析純） 成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設備

JLGJ-45型檢驗礱谷機 浙江臺州市糧儀廠；Cyclotec 1093型旋風式樣品磨 丹麥FOSS公司；DHG-9040S電熱恒溫鼓風干燥箱 寧波東南儀器有限公司；BS223S電子天平 德國Sartorius公司；2-16PK高速冷凍離心機 賽多利斯科學儀器有限公司；RE-2000A型旋轉蒸發器 上海嘉鵬科技有限公司；752PC型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；1200型高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 原料的預處理

將糜子樣品用檢驗礱谷機脫殼后，分別將糜子的麩皮和糜米粉碎成粉末狀，分裝，－20 ℃保存備用。

1.3.2 含水量的測定

準確稱取各糜子樣品的麩皮及糜米m1，用錫箔紙包好后放在烘箱內，于110 ℃烘干72 h，取出后稱得烘干后樣品質量m2，按式（1）計算樣品含水量：

式中：m1為樣品的初始質量/g；m2為樣品烘干后的質量/g。

1.3.3 自由酚的提取

將糜子麩皮（或糜米）與95%乙醇溶液按1∶30或1∶15（g/mL）的比例混勻，充分振蕩混合提取5 min后，2 500 r/min離心10 min，收集上清液，重復3 次，合并上清液，于75 ℃水浴條件下旋轉蒸干，用去離子水定容至5 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾，分裝，－20 ℃保存備用。

1.3.4 總酚含量的測定

1.3.4.1 標準液的制備

準確稱取沒食子酸25 mg溶于25 mL去離子水中，得到標準溶液的母液。將母液稀釋至系列質量濃度為0、20、60、100、150、200、300、400、500、600 μg/mL的標準液，避光保存。

1.3.4.2 總酚含量的測定

采用福林-酚法測定總酚含量[23]。在玻璃培養管中加入100 μL樣品液（或標準溶液）、400 μL去離子水和100 μL福林-酚試劑，充分混勻，反應6 min。再加入1 mL 7 g/100 mL的Na2CO3溶液和0.8 mL去離子水，充分混勻，室溫條件下避光靜置90 min。在760 nm波長處測定吸光度。多酚含量以每100 g樣品干質量中對應的沒食子酸的質量表示（mg沒食子酸/100 g樣品）。

1.3.5 高效液相色譜檢測樣品中多酚的成分和含量

1.3.5.1 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流速0.5 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長280 nm；流動相為乙腈-水（2∶8，V/V，pH 3.0）。

1.3.5.2 標準液的配制

準確稱取酚酸標準品各30 mg溶于少量流動相中，溶解后移至100 mL容量瓶，用流動相定容至100 mL，得到酚酸標準品的母液。將標準母液稀釋至系列質量濃度，以備檢測各酚酸的標準曲線。

1.3.5.3 色譜峰分離度的計算

將配制好的標準溶液混合進樣，按1.3.5.1節色譜條件分析，按式（2）計算色譜峰分離度R：

式中：t1為色譜峰1的保留時間/min；t2為色譜峰2的保留時間/min；y1為色譜峰1的峰寬；y2為色譜峰2的峰寬。R＞1.5即為完全分離。

1.3.5.4 加標回收率

將酚酸標準液稀釋至一定質量濃度，取100 μL，再加入100 μL待測樣品液，充分混勻后檢測加標回收率。

1.4 數據分析

以上實驗每份樣品做3次重復，結果表示為平均值±標準偏差。使用Excel 2010分析數據并繪制柱狀圖；使用SPSS 19.0進行方差顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 樣品含水量

表 1 不同品種糜子的含水量Table 1 Water contents in different varieties of proso millet%

如表1所示，糜子麩皮的含水量為7.33%～8.29%，糜米的含水量為10.19%～11.35%，糜子麩皮中水分含量少于糜米，且品種間差異顯著（P＜0.05）。

2.2 總酚含量的測定

2.2.1 沒食子酸標準曲線

采用福林-酚法繪制沒食子酸標準曲線的回歸方程為Y=0.002 2X＋0.021 7，R2=0.998 7，可以用于測定酚酸含量。

2.2.2 樣品中自由態酚酸含量

圖 1 不同品種糜子的自由酚含量Fig.1 Free phenol contents in different varieties of proso millet

由圖1和表2可知，糜子麩皮中自由酚含量為114.57～159.22 mg沒食子酸/100 g樣品，不同品種糜子麩皮之間自由酚含量沒有顯著性差異。糜米中自由酚含量為26.84～47.98 mg沒食子酸/100 g樣品，不同品種糜子糜米之間自由酚含量差異極其顯著（P＜0.01）。赤糜2號麩皮和糜米自由酚含量最高，麩皮159.22 mg沒食子酸/100 g樣品，糜米47.98 mg沒食子酸/100 g樣品。粘豐7號麩皮和糜米之間自由酚含量差異顯著（P＜0.05），其他品種同一品種間麩皮和糜米的自由酚含量差異極其顯著（P＜0.01），糜子麩皮自由酚含量遠高于糜米。

表 2 不同品種糜子的自由酚含量Table 2 Free phenol contents in different varieties of proso millet mg沒食子酸/100 g樣品

2.3 高效液相色譜法分析樣品多酚提取物

2.3.1 標準品的測定

將配制好的標準溶液混合進樣，按1.3.5.1節色譜條件分析，綠原酸與丁香酸之間分離度為20.90，丁香酸與香草酸之間分離度為2.59，香草酸與p-香豆酸之間分離度為22.11，p-香豆酸與阿魏酸之間分離度為10.69。綠原酸、丁香酸、香草酸、p-香豆酸、阿魏酸均能良好分離（圖2）。

圖 2 混合酚酸類標準溶液分離色譜圖Fig.2 Chromatogram of mixed pheolic acid standards

2.3.2 高效液相色譜加標回收率

表 3 加標回收率Table 3 Spike recoveries of 5 pheolic acids

由表3可知，5種酚酸標準品的加標回收率為93.2%～104.1%，說明實驗方法準確度較高。

2.3.3 高效液相色譜法測定糜子樣品多酚含量

由表4可知，糜子中酚酸類物質有綠原酸、丁香酸、香草酸、p-香豆酸、阿魏酸，種類豐富。麩皮和糜米中均含有丁香酸和p-香豆酸，其含量分別為丁香酸0.85～1.63 mg/100 g樣品（麩皮）、丁香酸0.39～1.00 mg/100 g樣品（糜米）、p-香豆酸1.33～2.06 mg/100 g樣品（麩皮）、p-香豆酸0.57～0.84 mg/100 g樣品（糜米）。白糜子、黃糜子、赤糜2號麩皮中均含有以上5種酚酸，其中綠原酸含量較高，分別為：白糜子2.94 mg/100 g樣品、黃糜子6.89 mg/100 g樣品、赤糜2號8.05 mg/100 g樣品。不同品種的糜子中酚酸類物質成分和含量均不相同，相同品種麩皮和糜米中酚酸的種類和含量差別明顯。

表 4 樣品中酚酸類成分及含量Table 4 Phenolic acids identified in different varieties of proso millet expressed as mg per 100 g sample mg/100 g樣品

3 結 論

本實驗對比了糜子麩皮和糜米中自由酚含量的差別，并利用高效液相色譜對糜子中酚酸類物質的種類和含量進行了研究。結果表明，不同品種糜子麩皮之間自由酚含量差異不顯著，不同品種糜子糜米之間自由酚含量差異極其顯著（P＜0.01）。赤糜2號麩皮和糜米中自由酚含量最高，麩皮中159.22 mg沒食子酸/100 g樣品；糜米中47.98 mg沒食子酸/100 g樣品。比徐元元等[24]報道的糜子自由酚含量高，可能是由于糜子品種不同?？梢姴煌贩N糜子多酚含量存在差異，有些品種的抗氧化潛力有待發掘，日后應進一步優化多酚的提取工藝。粘豐7號麩皮和糜米之間自由酚含量差異顯著（P＜0.05），其他品種同一品種間麩皮和糜米自由酚含量差異極其顯著（P＜0.01），糜子麩皮自由酚含量遠高于糜米。這與汪海波等[25]對燕麥中抗氧化成分的研究結果相似（燕麥麩皮抗氧化成分高于胚乳）。

5種酚酸標準品的加標回收率為93.2%～104.1%，說明本實驗方法準確度較高。糜子中酚酸類物質有綠原酸、丁香酸、香草酸、p-香豆酸、阿魏酸，種類豐富。麩皮和糜米中均含有丁香酸和p-香豆酸，白糜子、黃糜子、赤糜2號麩皮中均含有綠原酸。不同品種糜子的酚酸類物質種類和含量不盡相同，相同品種糜子麩皮和糜米中酚酸類物質種類和含量差別明顯。結果表明，糜子麩皮中酚酸類物質含量豐富，有較高的利用價值，但在生產中往往都被廢棄，今后需要對糜子中酚酸類物質提取工藝和作用機制進行深入研究，以期為生產實踐提供依據。

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