高速逆流色譜法分離綠茶中的化學成分

王 尉，林 楠，樂勝鋒，王 覃，周曉晶，趙新穎，杜 寧，張經華

（北京市理化分析測試中心，北京 100089）

茶葉在我國有數千年的飲用歷史，同時歷代藥書中也有茶葉入藥的記載。通過研究表明，茶不僅能止渴、提神醒腦、消除疲勞，還具有抗衰老、抗輻射、抗菌消炎、降低血糖血脂、防治心腦血管病等多種生理功能。茶多酚作為是茶葉中重要的活性成分，其在茶葉中含量很高，約占茶葉干質量的25%～35%，主要含有6 類成分：黃烷醇類、4-羥基黃烷醇類、花色苷類（花青素類、花白素類）、黃酮類、黃酮醇類和酚酸及縮酚酸類。其中以黃烷醇類（主要是兒茶素類化合物）最為重要，占茶多酚總量的60%～80%。兒茶素不僅僅對茶葉的滋味具有重要的作用，而且大量的研究表明兒茶素還具有重要的生物活性，在抗氧化、清除自由基[1-4]、抗輻射[5]、抗病毒[6-7]、抗菌消炎[8-9]、降血壓血脂[10-14]和預防癌癥[15-20]等方面具有重要的功能。

高速逆流色譜（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）作為20世紀70、80年代間發展起來的一種連續高效的液-液分配色譜分離技術[21-22]，結合了液-液萃取和分配色譜的優點，是一種無需任何固態載體或支撐的液-液分配色譜技術。其根據樣品在兩相中分配系數的不同達到樣品之間相互分離的目的。HSCCC具有無不可逆吸附、回收率高、進樣量大[23]等特點。該技術在綠茶化學成分分離中也得到了較好的應用。Cao Xueli等[24]對綠茶提取物進行兩步HSCCC分離，可以得到EGCG、GCG、ECG 3 種兒茶素成分。成超等[25]采用高效逆流色譜（high-performance countercurrent chromatography，HPCCC）對兒茶素粗品進行分離，在120 min內一次制備即可得到兒茶素和表兒茶素兩種兒茶素異構體。但是，尚未有綠茶活性成分HSCCC分離純化方法系統性研究的相關報道。本實驗應用HSCCC技術對市售綠茶進行活性成分研究，通過對綠茶有效部位的分段萃取和多種HSCCC溶劑系統的分離，共得到8 種高純度單體化合物，具有較好的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、正己烷、甲醇、磷酸（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；甲醇（色譜純） 美國Fisher scientific公司；咖啡堿（caffeine，CFA）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素（epicatechin，EC）、兒茶素（catechin，C）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（gallocatechin gallate，GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、沒食子酸（gallic acid，GA）（對照品） 上海融禾醫藥科技有限公司；龍井綠茶 北京吳裕泰茶業股份有限公司。

1.2 儀器與設備

TBE-300B半制備型高速逆流色譜儀 上海同田生物技術有限公司；LC-20A高效液相色譜儀（配SPDM20A檢測器） 日本Shimadzu公司；ALPHA 1-2 plus冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 對照品溶液配制

稱取CFA、EGC、EC、C、EGCG、GCG、ECG、GA對照品各10 mg分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，可得1 mg/mL對照 品溶液。再從其中分別吸取1 mL溶液置于10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，即單個對照品的質量濃度均為0.1 mg/mL。

1.3.2 高效液相色譜條件

Diamonsil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.2%磷酸溶液（A）-甲醇（B），線性梯度洗脫，20%～80% B（0～30 min），流速：1 mL/min；檢測波長：274 nm；柱溫：30℃。

1.3.3 樣品的提取

將綠茶粉碎過0.3 mm篩，稱取綠茶粉末200 g，加入80%乙醇2 L，60 ℃回流提取3 次，每次1 h，過濾，合并濾液，減壓回收乙醇得提取物浸膏。所得浸膏用蒸餾水分散，分別用二氯甲烷和乙酸乙酯萃取3 次，合并萃取液，減壓回收溶劑得二氯甲烷和乙酸乙酯浸膏，備用。剩余水相蒸干，備用。

1.3.4 溶劑選擇和高速逆流色譜操作過程

對于綠茶中兒茶素等化學成分的HSCCC分離均采用乙酸乙酯-水的中等極性溶劑體系，根據待分離化合物的極性進行輔助溶劑的選擇。對于極性較大的EGC和CFA采用正丁醇-乙酸乙酯-水的極性溶劑體系；對于EC、C、EGCG、GCG等兒茶素類成分，可按照化合物的極性強弱調節溶劑體系中正己烷的比例，以到達良好的分離效果。

將選定的溶劑體系充分混合后，靜置分層，上相為固定相，下相為流動相。先以10 mL/min的流速泵入固定相，待固定相充滿管道后。打開主機調整轉速為900 r/min，主機正轉，當達到設定轉速時，以2 mL/min的流速泵入流動相。主機溫度控制在25 ℃，檢測波長設定為280 nm，當流動相從主機出口流出時進樣。

2 結果與分析

2.1 綠茶的提取

對綠茶粉末采用80%乙醇，料液比1:10（g/mL），60 ℃回流提取1 h，濾渣重復2 次，合并濾液，減壓濃縮，所得浸膏在60 ℃烘箱中干燥至恒質量，計算樣品浸膏的提取率為13.8%。通過對綠茶提取物和混合對照品溶液進行HPLC分析，如圖1所示，結果表明綠茶中以兒茶素為主要的活性成分均已被提取出來。

圖 1 綠茶提取物（A）對照品（B）HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference standards

2.2 綠茶化學成分分離純化

對二氯甲烷萃取物采用正丁醇-乙酸乙酯-水（0.2∶1∶2，V/V）溶劑體系進行HSCCC分離，可得到CFA，如圖2、3所示。對乙酸乙酯部位首先采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（0.8∶5∶1∶5，V/V）溶劑體系進行第1次HSCCC分離，將收集的組分分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，其中第Ⅳ組分為ECG（如圖4、5），對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分進行第2次HSCCC分離，溶劑體系分別為正丁醇-乙酸乙酯-水（0.2∶1∶2，V/V）、正己烷-乙酸乙酯-水（1∶20∶20，V/V）、正己烷-乙酸乙酯-水（1∶8∶8，V/V），可得到EGC、EC、C、EGCG、GCG，見圖6～11。對水相萃取物采用乙酸乙酯-乙醇-水（5∶0.5∶ 6，V/V）溶劑體系進行HSCCC分離，可得到GA，如圖12、13所示。

圖 2 二氯甲烷萃取物的HSCCC色譜圖Fig.2 HSCCC chromatogram of dichloromethane extract

圖 3 二氯甲烷萃取物純化后HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of purified dichloromethane extract

圖 4 乙酸乙酯萃取物HSCCC色譜圖Fig.4 HSCCC chromatogram of ethyl acetate extract

圖 5 乙酸乙酯萃取物純化后HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of purified ethyl acetate extract and purified fractions

圖 6 峰Ⅰ的HSCCC色譜圖Fig.6 HSCCC chromatogramof peakⅠ

圖 7 峰Ⅰ純化后EGC的HPLC色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of purified peakⅠ

圖 8 峰Ⅱ的HSCCC色譜圖Fig.8 HSCCC chromatogram of peak Ⅱ

A.峰Ⅱ純化后的EC；B.峰Ⅱ純化后的C；C.峰Ⅱ純化后的EGCG。

圖 10 峰Ⅲ的HSCCC色譜圖Fig.10 HSCCC chromatogram of peak Ⅲ

圖 11 峰Ⅲ純化后GCG的HPLC色譜圖Fig.11 HPLC chromatogram of purified peak Ⅲ

圖 12 水相萃取物的HSCCC色譜圖Fig.12 HSCCC chromatogram of water extract

A.水相萃取物；B.純化后GA。

3 結 論

本實驗采用HSCCC的方法，從綠茶原料中分離得到CFA、EGC、EC、C、EGCG、GCG、ECG、GA 8 種單體化合物，其純度分別為99.5%、97.2%、98.2%、97.6%、98.8%、99.1%、99.2%和98.8%。其中包含EGCG等6 種兒茶素類化合物以及沒食子酸和咖啡堿。尤其對于綠茶中含量較低的C（提取物中的質量分數為5‰，下同）、EC（7‰）、EGC（8‰）3 種兒茶素類化合物，通過2 次HSCCC分離，即可得到高純度單體，該方法簡便可行。

HSCCC法較常規柱色譜的分離方法，無需多種固定相填料，僅通過對不同溶劑系統選擇便可達到對不同化合物的分離純化，具有成本低廉、分離快速的優點。因而顯示了HSCCC法在天然產物活性成分研究開發中的應用價值，同時，也可為中草藥質量控制過程中所需要的高純度單體的制備提供了一種簡單實用的方法。

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