甘草酸和甘草黃酮與人肝癌細胞(Hep G2)作用的電化學研究

姜項福 劉文杰，2 白紅進，2*

甘草是豆科(Leguminosae)甘草屬(Glyeyrrhiza)，在許多國家都有分布，而甘草屬植物總共有20種，僅在中國就分布達12種，其中新疆占了9種。甘草曾廣泛分布西北部各地區，不過由于人為的原因，原主產甘草的山西、陜西、山東及東北三省，現已絕跡或分布甚少，現在能提供野生商品藥材的省區僅內蒙古、新疆、寧夏、甘肅、青海和陜西的榆林地區等，而以新疆蘊藏量較多，種質資源也最豐富。根據2000年版《中華人民共和國藥典》中記載，甘草的原植物有3種，即烏拉爾甘草、脹果甘草和光果甘草三種。在我國，甘草作為一種中藥材，已有2 500多年治療疾病的歷史，現在隨著對甘草研究的進一步發展，其已廣泛應用于醫藥、食品、化工等領域。甘草中含有甘草酸、甘草甙、甘草類黃酮、生物堿等多種生物活性成分，其中，甘草酸和甘草類黃酮等是最重要的活性成分。研究表明，甘草酸具有如抗炎、解毒、保肝等功效，甘草酸以及甘草酸注射劑，可用于治療慢性乙型、丙型肝炎，戊型肝炎等，效果不錯［1－2］;它可以應用于改善上呼吸道感染的癥狀［3］;在SARS病毒廣泛流行的時候，也有人把甘草酸應用到 SARS 臨床治療的報導［4］;Chan 等［5］發現甘草酸能對黃曲霉素B1誘導的細胞毒有較好的保護作用;范明浩［6］在研究中發現甘草酸也能直接抑制與哮喘相關的炎癥細胞，很好地控制哮喘的發病癥狀。甘草黃酮是一類成分復雜的混合物，目前已知成分達150多種，單體提取非常困難，所以通常的甘草黃酮實際為黃酮類化合物的混合物。對甘草黃酮的研究也表明，甘草黃酮具有明顯的清除自由基以及抑制腦組織脂質發生過氧化反應的作用［7］;甘草黃酮有較強的抑制酪氨酸酶活性和黑素生成的作用，同時對黑素細胞的細胞毒性較低，是較為安全有效的美白藥物［8］;蔡云清等［9］在研究中發現，甘草黃酮能誘導肝癌SMMC－7721細胞凋亡，可抑制SMMC－7721細胞增殖，并呈時間劑量效應。

細胞是生命體結構和功能的基本單位，細胞研究是揭示生命的奧秘和征服疾病的基礎環節之一。考察細胞的形態變化、功能變化和周圍生化環境的變化，可加深了解細胞的生理過程，這對生命科學自身的發展和生物醫藥、分析技術和材料科學等的進步都將有重要的促進作用。電化學方法是分析化學領域中一種經典的分析測試方法，具有效率高、耗費低(儀器和試劑均價格較低)、毒性小和重現性好等優點，在各種細胞研究中已經得到了廣泛的應用。目前報導的應用較多的電化學方法，主要有細胞的伏安法檢測［10－12］、阻抗法檢測［13－14］、掃描電化學顯微鏡法檢測［15－16］等。相比較于通常的細胞毒實驗方法，如MTT染色法，熒光法以及透射電鏡觀察法等，雖然實驗的結果比較令人滿意，但是有的方法所用試劑毒性較大，對人具有很強的致癌性，而有的方法所用到的儀器價格昂貴，缺乏廣泛的應用性。電化學方法的引入，無疑是對細胞研究領域的促進和發展，有著很重要的意義。

實驗通過以肝腫瘤細胞HepG－2為體外研究模型，利用ITO導電玻璃具有良好的透光性能和導電性能，自制了一組工作電極，借助電化學方法和顯微鏡觀測等手段，評估了甘草酸和甘草黃酮對腫瘤細胞的細胞毒性的影響。甘草酸作為一種比較常見的天然產物成分，已經在醫療和衛生保健領域展現出了很大的應用前景。通過各方面的研究，若是能充分利用新疆的這些特色的優質的甘草資源，積極開發出其最大的應用價值，使之廣泛應用到新穎的保健、防癌抗癌藥物的開發和研制中，對經濟、社會發展都將產生非常重要的意義。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

光透性氧化銦錫導電玻璃(ITO)購自深圳南玻技術有限公司，厚1.1 mm，涂層為78.5±1.5 m的氧化銦錫薄層，熱阻為20.6±2.5Ω/cm2，手動切割成1.5 cm×1.5 cm的薄片。

電化學實驗均是使用CHI 660D電化學工作站(上海辰華儀器有限公司，中國)進行，采用常見的三電極系統檢測。其中自制的ITO導電玻璃電極作為工作電極，參比電極和對電極分別為飽和甘汞電極(SCE)和鉑電極。所有電化學測試均在室溫下進行。

使用倒置光學顯微鏡(奧林巴斯 CKX41，日本)觀察了細胞的生長形態，并通過連接于顯微鏡上的數碼相機(奧林巴斯CKX41，日本)對細胞進行拍照。

人肝癌細胞HepG2購自中科院上海細胞庫，培養基為添加了10%新生牛血清的RPMI1640，實驗中使用的緩沖溶液為pH=7.4的磷酸緩沖溶液(PBS，1.56 g/L Na2HPO4· H2O +0.20 g/L KH2PO4+8.00 g/L NaCl+0.20 g/L KCl)。

甘草酸和甘草黃酮的測試樣品由塔里木大學塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室提供。

實驗中所用的試劑均為分析純，配制試劑的如無特殊說明均為蒸餾水。

1.2 ITO工作電極的制作

首先用洗滌劑仔細清洗氧化銦錫導電玻片(ITO)，浸于丙酮中置于超聲儀中超聲兩次，每次5分鐘。然后用超純水清洗，并在超純水超聲5分鐘。用氮氣流干燥后，將ITO導電玻片放入高壓高溫蒸汽中滅菌30分鐘，最后于烘箱中60℃條件下干燥待用。

用702白硅膠將切割好的5 mL塑料離心管管身(高度3 cm，內徑2 cm)與已滅菌的ITO導電玻片粘貼好制成細胞培養池，再將5個同規格的培養池以硅膠固定在挖有圓孔的硬質塑料板上，分別標記為1、2、3、4、5號。用導電膠將銅導線與ITO導電玻片連接，測試其導電性，然后用環氧樹脂作為絕緣體覆蓋其余部位，做成實驗所用的細胞培養池及電化學工作電極。如圖1所示。

圖1 自制ITO導電玻璃電極示意圖

1.3 細胞培養與傳代

培養基、PBS、胰蛋白酶先放置于37℃的恒溫水浴鍋中預熱，打開紫外燈照射超凈工作臺30分鐘。用75%酒精噴灑雙手消毒，并擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺。點燃酒精燈，準備好吸量管和預熱好的培養基、PBS、胰蛋白酶(取出時均需以酒精消毒試劑瓶)待用。從培養箱(37℃，5%CO2，濕度95%)內取出細胞，在顯微鏡下觀察細胞生長情況后置于超凈工作臺中。將原培養液倒入廢液缸中，取適量PBS清洗三次。加入1.5 mL胰蛋白酶消化液，在倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度，立刻倒棄消化液并加入2～3 mL培養基停止消化。接著用吸量管輕柔地吹打成細胞懸液全部轉移至離心試管，離心分離5分鐘。棄去上清液，加入2～3 mL培養液，用吸管輕輕吹打細胞再次制成細胞懸液。取1/3體積的細胞懸液轉移至一個新的培養瓶，添加8～10 mL培養基，搖勻后將培養瓶(瓶蓋不能擰緊，以免細胞缺氧)置于CO2培養箱中讓細胞貼壁生長。剩余細胞計數后加適量數目到自制電極中培養，作為電化學測試對象。

1.4 細胞測定

將五個培養池置于紫外線下消毒30分鐘后用PBS清洗三次，在每個培養池加入20 000個剛消化的Hep G2細胞，補充培養基使溶液體積至1 000 μL。然后置于CO2恒溫培養箱培養24小時，此時細胞已經粘附鋪展在ITO導電玻片電極表面，并處于對數生長期。此時，更換2 mL含有各種不同濃度的藥物(分別為1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 g/L 的甘草酸和甘草黃酮)的培養基，將細胞繼續培養24小時，取出電極，以PBS輕洗2～3次，進行細胞觀察拍照和電化學測量實驗。所有電化學實驗是在濃度均為1 mmol/L鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀探針溶液(其中含0.1 mol/L的KCl作為支持電解質)中以及室溫下進行。

2 結果和討論

2.1 甘草酸和甘草黃酮的電化學表征

分別把1.500 0 g淡黃色甘草酸粉末和1.500 0 g褐色甘草黃酮溶于100 mL容量瓶中，加入自制的pH=7.4的PBS緩沖溶液在超聲波作用下溶解并定容。然后分別吸取0.5 mL配制好的甘草酸溶液和甘草黃酮溶液至ITO電極，設置電化學工作站參數中的掃描速率為100 mV/s，對該兩種物質進行電化學測試。

圖2 甘草酸(A)和甘草黃酮(B)在PBS中的電化學循環伏安圖。(掃描速率:100 mV/s)

從圖2(A)中可以看出，在中性條件下，甘草酸的循環伏安圖中，電勢范圍從－0.5 V～1.0 V，均無明顯的氧化還原峰的出現，而由圖2(B)可以看出，甘草黃酮在－0.4 V～0.6 V范圍內也并無明顯的氧化還原峰電流出現。考慮到實驗中用到的鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀氧化還原探針溶液在實驗中通常所設定的電勢范圍為－0.1 V～0.5 V之間，而在這個范圍內，甘草酸和甘草黃酮均沒有明顯的氧化還原峰，所以實驗過程中有少量的藥品殘留也不會對測定的實驗結果產生明顯的干擾作用。

2.2 甘草酸和甘草黃酮對Hep G2細胞的生長抑制作用

細胞吞噬了一定量的藥物或者納米粒子，在這些外來物質的刺激作用下，會產生細胞的凋亡現象，即體現出這些刺激物的細胞毒性。試驗中，分別加入了不同濃度的甘草酸和甘草黃酮，借助于電化學工作站和光學倒置顯微鏡，直觀的比較了甘草酸以及甘草黃酮對Hep G2細胞的細胞毒性大小，所得結果可見圖3和圖4。

圖3 (A)甘草酸，(B)甘草黃酮分別與細胞作用24小時后的循環伏安圖(實線圖1～4對應濃度均分別是1.0、1.5、2.0、2.5 g/L)。掃速為100 mV/s。探針溶液為含0.1 mol/L KCl支持電解質的鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀(0.1 mmol/L:0.1 mmol/L)。

在以鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀探針溶液為電子媒介體的電化學測試中，工作電極的導電性能主要可以氧化還原峰電位的差值以及氧化還原峰型來評判。圖3(A)和圖3(B)中虛線CV圖是ITO電極在加了無藥物培養基培養48小時后在探針溶液中測量所得，其中最里邊虛線部分為加入了細胞的培養基所測得的CV圖，發現氧化峰和還原峰的峰－峰電位差分別達到了0.155 V和0.153 V，氧化峰電流分別為49μA和52μA;而最外邊的虛線部分則是加入了無細胞的培養基后所測得的CV圖，氧化峰和還原峰的峰－峰電位差分別為0.093 V和0.090 V，氧化峰電流分別為197μA和198μA。當培養基加入到電極中48小時后，同時可以看到加入了細胞懸液的電極表面覆蓋了一層細胞之后，電極的峰電流明顯降低，峰－峰電位差顯著增大，這說明細胞在電極表面貼壁生長以及一些培養基中的有機蛋白質分子吸附，大大阻礙了電極和探針溶液之間的電子傳遞，使得電極的導電性能顯著降低。

圖3(A)中實線CV圖為含不同濃度甘草酸的培養基與細胞作用24小時后測試所得，可以看到，隨著甘草酸濃度的增大，電極的峰－峰電位差減小，而峰電流逐漸增大。在濃度為1.0 g/L和1.5 g/L時，對應于圖3(A)中的實線1和2，電極的氧化峰電流相比于無甘草酸時要有所增大，分別為55μA和63μA，但幅度較小，說明該濃度對細胞的生長抑制作用但并不明顯;而當濃度增加到2.0 g/L和2.5 g/L時，氧化峰電流顯著增大，達到了101μA和150μA，說明細胞在該濃度的甘草酸作用下，凋亡數目大大增加，吸附在電極表面的細胞大大減少，使得電極和探針溶液之間的電子傳遞變得更為順暢。圖3(B)中實線CV圖為含不同濃度甘草黃酮的培養基與細胞作用24小時后測試所得，可以看到，在測試的濃度范圍內，隨著加入的藥物濃度的增大，電極的峰－峰電位差也在逐漸減小，而峰電流也依次增大，但沒有明顯的突越變化，與圖3(A)比較即可以看出。這說明在該濃度范圍內，細胞對甘草酸的刺激反應比對甘草黃酮的反應更加敏感，甘草酸對細胞的生長抑制效果也要優于甘草黃酮。

通過數碼相機對細胞的數量變化進行了實時拍照，如圖4中所示。圖4(A1－A5)為細胞與不同濃度甘草酸的作用24小時后的照片。A1為未加甘草酸的對照圖，與A2～A5比較可以看到，隨著甘草酸的濃度增大，ITO電極表面的細胞數量逐漸減少，尤其從A3和A4的比較中可明顯看到電極表面細胞數量的變化，A5中細胞數量已經比較稀少。這也印證了電化學測試的結果。圖4(B1～B5)為細胞與不同濃度甘草黃酮作用24小時后的照片。B1為對照圖，從B2～B5中可以看到，隨著甘草黃酮濃度增大，ITO電極表面的細胞數量逐漸減少，但并沒有出現顯著細胞數量的變化。這與電化學實驗結果也是一致的。

圖4 濃度均分別是0、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L的甘草酸(A1～A5)，甘草黃酮(B1～B5)與細胞作用24小時后的照片。

結果表明，甘草酸和甘草黃酮都會對肝癌細胞Hep G2產生抑制殺傷作用，但在較低濃度時，甘草酸的抑制殺傷作用要更為顯著，并且有明顯的突越變化。

2.3 甘草酸對Hep G2細胞的抑制效率研究

通常可把藥物對細胞的殺傷抑制效率(Inhibition Efficiencies，IE)定義為:

公式中I0是ITO電極中加入無細胞的培養基24小時后所測得的陽極峰電流值，I1和I2分別是培基中不含和含有藥物時，細胞培養48小時后所測得的陽極峰電流。公式中分母(I0－I1)表示細胞引起的電極電化學活性和導電性的降低;分子(I2－I1)則表示加入了藥物后對細胞的抑制效果。

通過同濃度的甘草酸和甘草黃酮對Hep G2細胞作用的效果表現，把甘草酸的濃度梯度范圍擴大，考察了其對腫瘤細胞的抑制效率，所得結果如圖5所示。從圖中可以看出在甘草酸濃度小于2.0 g/L時，其對Hep G2細胞的抑制作用較小，沒有超過20%;而當濃度大于2.0 g/L時，抑制效率增幅明顯變大，達到了38%，當濃度增大到4.0 g/L時，抑制效率增至76%，而通過顯微鏡觀測，見圖4(A)，可看到此時ITO電極上細胞存活的數量已經很少。這也說明甘草酸在較大濃度時，對腫瘤細胞的殺傷效果已經很顯著。但隨著濃度的繼續增大，其對細胞的抑制率變化幅度已經很小，說明此時影響電極與氧化還原探針溶液的電子傳導已經不是由于細胞的阻礙，而是培養基中大量的有機營養物質吸附在電極表面造成了電子在探針溶液中的傳導不利。

在相同條件下做了三次平行實驗，由于細胞培養體系中成分的復雜性，相對偏差的范圍在6.0%－13.0%(見圖5)，說明本實驗采取的電化學檢測手段是可行的，基本達到了預期的目的。

3 結論

通過電化學循環伏安法以及光學顯微鏡觀測的方法，研究了甘草酸和甘草黃酮兩種天然產物與人肝癌細胞Hep G2的相互作用，發現甘草酸和甘草黃酮都能抑制Hep G2細胞的生長繁殖，并且其效率和培養基中的濃度相關，濃度越大，抑制率越高，呈現出相應的濃度依賴性。其中甘草酸的細胞抑制效率較甘草黃酮要更強一些，當甘草酸的濃度達到2.0 g/L時，其對細胞的生長抑制出現顯著提高，而甘草黃酮并沒有出現明顯變化。在接下來的工作中，應該考慮把這幾種甘草的提取物與腫瘤細胞和正常細胞分別作用，考察其對不同細胞的作用是否會存在著特異性，以及對細胞體中小分子結構和含量的影響。

圖5 不同濃度甘草酸對Hep G2細胞的抑制率

研究開發出一些低濃度、低毒高效的防癌抗癌藥物，一直是各國科學家和醫療專家的目標，而已知的人工合成的化學抗癌藥物是很難達到要求，所以在近幾年，天然產物以及中草藥已經成為藥物開發包括癌癥治療領域的一個備受關注且極具潛力的研究對象。通過本研究，希望能夠為新疆豐富的甘草資源的充分開發利用提供一些理論上的支撐。

4 致謝

實驗過程中得到了湖南師范大學國家重點實驗室譚亮副教授的很多幫助，同時也得到了基礎實驗樓無機實驗室洪遠新老師和分析實驗室的蔣卉老師的幫助，在此深表感謝。

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