經皮穴位電刺激對高齡婦女卵細胞質量及Bcl-2、Bax的影響

連方,劉菲,帥振虹

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經皮穴位電刺激對高齡婦女卵細胞質量及Bcl-2、Bax的影響

連方1,劉菲2,帥振虹2

(1.山東中醫藥大學附屬醫院,濟南 250011;2.山東中醫藥大學,濟南 250014)

觀察經皮穴位電刺激對體外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期腎虛高齡婦女卵顆粒細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達及卵細胞質量的影響。將66例因輸卵管因素行IVF-ET的腎虛高齡婦女隨機分為治療組(經皮穴位電刺激治療)和對照組(偽針),每組33例。觀察兩組患者腎虛證候積分變化,HCG日單個卵雌激素(E2/卵泡數)、優卵率、優胚率、臨床妊娠率的差異,并應用蛋白印跡法(Western blot)檢測卵顆粒細胞Bcl-2、Bax蛋白表達。與對照組相比,治療組患者腎虛癥狀明顯改善(＜0.01),HCG日E2/卵泡數、優卵率、優胚率明顯升高(＜0.05),Bcl-2蛋白表達明顯增多(＜0.01),Bax蛋白表達明顯降低(＜0.01),獲卵數和臨床妊娠率無顯著差異(＞0.05)。Bcl-2、Bax蛋白表達與IVF相關參數有明顯相關性(＜0.05)。經皮穴位電刺激能改善高齡婦女腎虛癥狀,提高卵細胞及胚胎質量,此作用可能與調節顆粒細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達,降低顆粒細胞凋亡有關。

經皮穴位電刺激;Bcl-2;Bax;卵細胞質量;體外受精-胚胎移植

女性生育能力隨著年齡的增長逐漸下降,35歲以后妊娠機會顯著減少。在助孕技術中,高齡婦女卵細胞質量下降成為制約其臨床妊娠率的關鍵因素。顆粒細胞通過縫隙連接,以自分泌和旁分泌的方式對卵細胞起營養支持、信息傳遞等重要作用。Bcl-2、Bax蛋白為B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族成員,定位于線粒體膜,通過調節線粒體膜電位和線粒體膜的通透性來調控顆粒細胞凋亡,分別起抑制和促進顆粒細胞的凋亡的作用[1]。本研究觀察經皮穴位電刺激對行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的腎虛型高齡不孕患者卵顆粒細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax表達及卵細胞質量的影響,現報道如下。

1 臨床資料

1.1 研究對象

66例患者來源于2013年3月至2013年9月山東中醫藥大學附屬醫院中西醫結合生殖與遺傳中心門診,隨機分為治療組和對照組,每組33例。兩組患者年齡、病程、治療前腎虛證候積分、治療前基礎內分泌水平比較差異均無統計學意義(＞0.05),具有可比性。詳見表1-2。

表1 兩組患者一般資料比較 (±s)

表2 兩組患者治療前基礎內分泌水平比較 (±s)

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準

符合樂杰主編《婦產科學》[2]中不孕癥診斷標準;符合中國中西醫結合學會婦產科專業委員會1990年第三屆學術會議修訂的“女性不孕癥的診療標準”[3]中輸卵管阻塞診斷標準。

1.2.2 腎虛中醫辨證標準

主證為不孕,經色淡黯,或者月經遲發,腰骶酸痛,脛膝酸軟或者足跟痛,舌質淡黯,苔白,兩尺脈沉細或者沉細弱;兼證為頭暈耳鳴,小腹冷,夜尿多,性欲減退。以上主證必須具備,兼證具備1～2項即可以診斷。

中醫癥狀積分標準[4],根據癥狀程度(癥狀影響日常生活;癥狀明顯;輕度癥狀;正常)分別積分,主證腰骶酸痛記6、4、2、0分,其余癥狀記3、2、1、0分。

1.3 納入標準

①年齡在35～45歲之間;②符合西醫輸卵管阻塞性不孕癥診斷標準;③符合中醫腎虛不孕癥辨證標準;④簽署知情同意書;⑤男方精液常規檢查正常。

1.4 排除標準

①其他原因所致不孕癥;②基礎內分泌FSH＞15mIU/mL者;③近3個月內應用激素類藥物者;④子宮不具備妊娠功能或嚴重軀體疾病不能承受妊娠者;⑤患有嚴重的精神疾患、泌尿生殖系統急性感染、性傳播疾病者;⑥患有《母嬰保健法》規定的不宜生育的遺傳性疾病者;⑦具有吸毒等嚴重不良嗜好者;⑧接觸致畸量的射線、毒物、藥品并處于作用期者。

2 治療方法

2.1 治療組

采用促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)長方案超促排卵。促性腺激素(gonadotropin,Gn)啟動日至應用絨促性素(HCG)日給予經皮穴位電刺激治療,將韓氏治療儀的電極貼片貼于相應穴位上,關元、中極為一對正負極,雙側子宮、三陰交分別為一對正負極,強度以患者能耐受為度,持續30 min,隔日1次。常規取卵、體外受精、胚胎培養及移植。

2.2 對照組

采用GnRH-a長方案超促排卵。偽針的使用時間和穴位與治療組相同,與患者交談分散患者注意力,使用偽針(將長25 mm毫針剪去0.5寸,將斷面打磨圓滑,穿于一橡膠片上)于相應穴位置模擬毫針刺法但不刺破表皮,僅使患者有點觸感,使其認為毫針已刺入皮膚,用膠布固定橡膠片從而固定針身。常規取卵、體外受精、胚胎培養及移植。

3 治療效果

3.1 觀察指標

3.1.1 腎虛證候積分

分別計算患者入組時和HCG日腎虛證候積分。

3.1.2 IVF相關參數

HCG日E2/卵泡數、獲卵數、優卵率、優胚率、臨床妊娠率。卵細胞形態學(成熟度)分級標準[5],Ⅲ級卵細胞為優質卵。胚胎按WIH評分系統[6],分數≥7分為優質胚胎。胚胎移植(ET)后4～5星期做陰道B超檢查,見胎囊、胎芽反射及胎心者診斷為臨床妊娠。

3.1.3 顆粒細胞Bcl-2、Bax蛋白表達

實驗室回收卵母細胞后,留取卵泡液,提取顆粒細胞,進一步純化后用Western blot法測定。

3.2 統計學方法

應用SPSS17.0統計軟件進行分析,計量資料以均數±標準差表示,采用獨立樣本檢驗,計數資料采用卡方檢驗;雙變量相關性分析采用相關分析。

3.3 治療結果

3.3.1 兩組患者腎虛證候積分比較

兩組患者HCG日腎虛證候積分及治療前后差值分別比較,差異均有統計學意義(＜0.01),治療組在腎虛證候改善方面優于對照組。詳見表3。

表3 兩組患者腎虛證候積分比較 (±s,分)

注:與對照組比較1)＜0.01

3.3.2 兩組臨床妊娠率比較

兩組患者臨床妊娠率比較差異無統計學意義(＞0.05),但治療組與對照組相比有增高趨勢。詳見表4。

表4 兩組臨床妊娠率比較 (n)

3.3.3 兩組患者IVF相關參數比較

與對照組相比,治療組HCG日E2/卵泡數、優卵率、優胚率均明顯升高(＜0.01),獲卵數無顯著差異(＞0.05),但治療組與對照組相比有增高趨勢。詳見表5。

3.3.4 兩組卵顆粒細胞Bcl-2和Bax蛋白表達比較

與對照組相比,治療組患者卵顆粒細胞Bcl-2蛋白表達顯著升高(＜0.01),Bax蛋白表達顯著降低(＜0.01)。詳見表6、圖1。

組別nE2/卵泡數(pg/mL)獲卵數(個)優質卵率(%)優胚率(%)E2/卵泡數(pg/mL) 治療組33259.77±25.451)13.58±6.55 82.85±19.421) 59.63±15.301) 259.77±25.451) 對照組33235.59±26.4412.03±6.6757.79±16.4037.72±27.63235.59±26.44

組別nBcl-2/actinBax/actin 治療組330.67±0.161) 0.34±0.171) 對照組330.50±0.200.51±0.20

注:與對照組比較1)＜0.01

圖1 治療組(4、5)對照組(1、2、3)Bcl-2、Bax蛋白表達

3.3.5 顆粒細胞Bcl-2、Bax蛋白與IVF相關參數相關性分析

兩組患者顆粒細胞Bcl-2與Bax蛋白表達呈明顯負相關(=-0.980,＜0.01);Bcl-2蛋白與HCG日E2/卵泡數呈明顯正相關(=0.325,＜0.01),與獲卵數呈明顯正相關(=0.634,＜0.01),與優卵率呈明顯正相關(=0.547,＜0.01),與優胚率呈明顯正相關(=0.717,＜0.01);Bax蛋白與HCG日E2/卵泡數呈明顯負相關(=-0.270,＜0.05),與獲卵數呈明顯負相關(=-0.653,＜0.01),與優卵率呈明顯負相關(=-0.493,＜0.01),與優胚率呈明顯負相關(=-0.694,＜0.01)。

4 討論

經皮穴位電刺激是對傳統針刺治療的改良,克服了針刺入皮膚時的疼痛感,無創[7],減少了長時間針刺造成的局部機械損傷,且刺激范圍大,操作方便,現亦被應用于輔助生殖領域。經皮穴位電刺激可從整體上調節機體內分泌和卵巢局部微環境,提高卵巢低反應患者臨床妊娠率[8],提高多囊卵巢綜合征患者卵泡液白血病抑制因子,改善其卵細胞和胚胎質量[9]。

中醫學認為腎虛在女性生殖機能衰老的過程中起決定作用,腎臟精氣虛衰,天癸少而竭,則經水無以行,卵細胞無以生,出現卵細胞發育不良、成熟延遲、萎縮及排出障礙等,導致高齡婦女生殖功能低下[10]。高齡不孕患者主要以腎精虛衰、沖任不固為基本特征,且使用外源性激素超促排卵,使多個卵泡生長發育成熟并取出,過度耗竭腎中陰陽,更易加重腎虛癥狀。故以補腎益精、調理沖任為基本治法,取關元、中極為主穴,以補腎益精培元,以三陰交、子宮為配穴,以調理沖任氣血。諸穴并用,以期達到補腎益精、調理沖任的目的。

本研究顯示,治療組患者腎虛癥狀改善程度、IVF相關參數均優于對照組,說明經皮穴位電刺激在改善高齡婦女腎虛癥狀、提高卵細胞及胚胎質量方面有顯著效果。與對照組相比,治療組患者卵顆粒細胞Bcl-2蛋白表達明顯升高,Bax蛋白表達明顯降低,且二者呈負相關,作為影響顆粒細胞凋亡的因素,Bcl-2蛋白具有抑制顆粒細胞凋亡作用,Bax蛋白具有促進顆粒細胞凋亡作用[1],說明經皮穴位電刺激可以調節顆粒細胞凋亡相關蛋白的表達,降低顆粒細胞凋亡。研究顯示Bcl-2蛋白表達與IVF相關參數均呈明顯正相關,Bax蛋白表達與IVF相關參數呈明顯負相關,說明卵顆粒細胞Bcl-2、Bax蛋白的表達與卵細胞和胚胎質量密切相關,可有效預測卵細胞、胚胎質量。綜上所述,經皮穴位電刺激可以通過補腎益精、調理沖任,改善高齡婦女腎虛癥狀,提高卵細胞及胚胎質量,此作用機理可能與調節卵顆粒細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax的表達,降低顆粒細胞凋亡有關。

[1] 王昭暉,張耀君,師紅,等.卵泡顆粒細胞凋亡相關蛋白的研究進展[J].生命科學,2009,21(4):494-498.

[2] 樂杰.婦產科學[M].第7版,北京:人民衛生出版社,2008: 351- 355.

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[6] Puissant F, Van Rysselberge M. Embryo scoring as a prognostic tool in IVF treatment[J]. Hum Reprod,1987,2(8): 705-708.

[7] 師小偉,刁樞.經皮穴位電刺激超前鎮痛對術后芬太尼鎮痛效果的影響[J].上海針灸雜志,2014,33(4):330-331.

[8] 邱文喜,張小玉.經皮穴位電刺激對卵巢低反應患者胚胎質量及妊娠結局影響的臨床觀察[J].中國性科學,2012,20(7): 22-24.

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[10] 王瑞霞,連方,孫振高.從現代生殖醫學角度探討“腎藏精主生殖”理論[J].遼寧中醫雜志,2010,53(9):1672-1674.

Effect of Transcutaneous Acupoint Electrical Stimulation on Oocyte and Bcl-2 and Bax in the Older Women

1,2,2.

1.250011,; 2.250014,

To observe the effect of transcutaneous acupoint electrical stimulation (TAES) on the ovarian granulosa cell apoptosis-related proteins, Bcl-2 and Bax, as well as the oocyte quality in the older women with kidney deficiency receiving in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET).Sixty-six older women with kidney deficiency who were receiving IVF-ET because of the fallopian tube factor were randomized into a treatment group (intervened by TAES) and a control group (intervened by sham acupuncture), 33 in each group. The kidney-deficiency syndrome score, HCG E2/follicle count per day, excellent follicle rate, excellent embryo rate, and clinical pregnancy rate were observed and compared between the two groups; Western blot was used to detect the expression of protein Bcl-2 and Bax.Compared to the control group, the treatment group had significant improvement in kidney-deficiency symptoms (＜0.01), significant increases in the HCG E/follicle count per day, excellent follicle rate, and excellent embryo rate (＜0.05), enhanced expression of Bcl-2 protein (＜0.01), and decreased expression of Bax protein (＜0.01); while there were no significant differences in comparing the retrieved oocyte number and clinical pregnancy rate (＞0.05). The expression of Bcl-2 and Bax proteins were markedly correlated with IVF-related indexes (＜0.05).TAES can improve the kidney-deficiency symptoms and the quality of oocyte and embryo in older women; this action is possibly related to the regulation of expression of the cell apoptosis-related protein Bcl-2 and Bax, as well as the decrease of granulose cell apoptosis.

Transcutaneous acupoint electrical stimulation; Bcl-2; Bax; Oocyte quality; In vitro fertilization-embryo transfer

1005-0957(2014)12-1097-03

R246.3

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.12.1097

2014-03-20

連方(1957 - ),女,主任醫師,博士