糠醛改性O(shè)-季銨化殼聚糖衍生物的合成及其抗菌性能

李瑋，李明春，辛梅華

（華僑大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境友好功能材料教育部工程中心，福建 廈門(mén) 361021）

殼聚糖作為天然抗菌高分子，具有無(wú)毒、生物相容性和生物降解性好、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，但是在中性介質(zhì)中溶解性差限制了其應(yīng)用范圍[1]。可以通過(guò)化學(xué)改性提高殼聚糖的水溶性，增強(qiáng)其抗菌活性，對(duì)殼聚糖的化學(xué)改性主要有烷基化、酰化和季銨化等，都能不同程度提高其水溶性。其中季銨化在提高水溶性的同時(shí)，由于引入正電性基團(tuán)，能與帶負(fù)電性的細(xì)胞膜結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜受損從而增強(qiáng)殼聚糖衍生物的抗菌效果[2]。

殼聚糖的NH2易與醛、酮類(lèi)化合物反應(yīng)生成席夫堿。席夫堿結(jié)構(gòu)中含有C=N鍵，其中N原子上的孤對(duì)電子使殼聚糖具有良好的化學(xué)配位性能，因此殼聚糖希夫堿衍生物具有良好的生物活性[3]。近年來(lái)，殼聚糖席夫堿的研究在不斷深入，已報(bào)道的有Santos等[4]研究的殼聚糖與水楊醛反應(yīng)生成席夫堿。金曉曉等[5]制備了殼聚糖檸檬醛席夫堿，研究表明產(chǎn)物的抗菌活性隨濃度的增加而增加，并且優(yōu)于殼聚糖本身；進(jìn)一步研究[6]表明殼聚糖肉桂醛席夫堿衍生物也具有較好的抗菌活性。Han等[7]制備了殼聚糖苯甲醛席夫堿，通過(guò)抑菌圈實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所得衍生物具有一定的抑菌效果。但殼聚糖與含有五元雜環(huán)的醛類(lèi)反應(yīng)生成的席夫堿衍生物的抗菌活性研究目前鮮有報(bào)道。因此在制備水溶性較好的O-季銨化殼聚糖基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使之與糠醛反應(yīng)制備 O-季銨化-N-呋喃亞甲基殼聚糖席夫堿及還原產(chǎn)物 O-季銨化-N-呋喃甲基殼聚糖衍生物，并比較研究其抗菌活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器及試劑

TU-1810 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器公司；FD-1B-50冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器公司；NEXUSU 470型傅里葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet公司；AvanceⅡ型核磁共振分析儀，瑞士 Bruker公司；Vario MICRO元素分析儀，德國(guó)Elementa 公司；Universal V2.4F TA熱分析儀，美國(guó)TA儀器有限公司；透析袋截留相對(duì)分子質(zhì)量范圍8000～14000，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司。

殼聚糖，相對(duì)分子質(zhì)量10萬(wàn)，脫乙酰度85%，濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司；苯甲醛（98.5%），縮水甘油三甲基氯化銨（70%），硼氫化鈉（96%），糠醛，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純。大腸桿菌（E. coli，ATCC DH5α）和金黃色葡萄球菌（S. aureus，ATCC 26003）由華僑大學(xué)分子藥物研究所提供。

1.2 O-季銨化殼聚糖的合成

[8]方法，將4.0 g殼聚糖、120 mL 2%的乙酸溶液和120 mL甲醇依次加入三頸瓶中， 攪拌溶脹1 h，將23.3 g苯甲醛溶解于80 mL甲醇后加入上述體系，50 ℃反應(yīng)4 h，過(guò)濾洗滌。濾餅用5% NaHCO3溶液浸泡，過(guò)濾洗滌，60 ℃真空干燥得N-苯亞甲基殼聚糖席夫堿[CS (BA)]，并研至粉末狀。稱(chēng)取1.0 g CS(BA)于三頸瓶中，將4.38 g縮水甘油三甲基氯化銨溶于70 mL異丙醇及少量蒸餾水中，緩慢滴加到分散于40 mL異丙醇的CS(BA)的三頸瓶中。70 ℃反應(yīng)8 h，抽濾，60 ℃真空干燥并研至粉末狀，得 O-季銨化-N-苯亞甲基殼聚糖席夫堿[O-HTCC (BA)]。將1.0 g O-HTCC(BA)分散于150 mL 0.5 mol/L 鹽酸-乙醇溶液中，40 ℃反應(yīng)24 h。抽濾洗滌，干燥后用無(wú)水乙醇索氏提取，40 ℃真空干燥得O-季銨化殼聚糖（O-HTCC）。

1.3 O-季銨化-N-呋喃亞甲基殼聚糖的合成

將0.5 g O-HTCC充分溶解于40 mL蒸餾水中，加40 mL異丙醇，攪拌，向體系中加入溶于40 mL異丙醇的糠醛1.80 g，40 ℃反應(yīng)6 h，得到O-季銨化-N-呋喃亞甲基殼聚糖席夫堿[O-HTCC(FF)]。NaBH4還原得產(chǎn)物 O-季銨化-N-呋喃亞甲基殼聚糖（O-FHTCC）。將O-HTCC(FF)和O-FHTCC過(guò)濾除去雜質(zhì)，濾液用蒸餾水透析3天，冷凍干燥。

制備路線(xiàn)見(jiàn)圖1。

1.4 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征及熱性能測(cè)試

采用溴化鉀（KBr）壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定各產(chǎn)物的紅外光譜。采用氘代水（D2O）作溶劑，用WP100SY 型核磁共振分析儀測(cè)定產(chǎn)物的核磁共振氫譜（1H NMR）。用VARIO EL III元素分析儀對(duì)產(chǎn)物元素進(jìn)行測(cè)定。在N2氣氛下，以10 ℃/min的升溫速率，在室溫到500 ℃的范圍內(nèi)升溫，用Universal V2.4F熱分析儀測(cè)定產(chǎn)物的熱重分析。

1.5 產(chǎn)物的抗菌性能測(cè)定

1.5.1 最低抑菌濃度測(cè)定

按照作者課題組的方法[9]配制樣品溶液及培養(yǎng)基并在 121 ℃下高壓滅菌 20 min。大腸桿菌（E.coli）及金黃色葡萄球菌（S. aureus）在培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間，使菌液濃度約為108CFU/mL（分光光度法測(cè)定）。

將濃度為1×104μg/mL的樣品溶液加入培養(yǎng)基中[10]，配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 0.4%，0.2%，0.1%，0.05%，0.025 %，0.0125%，0.00625%，0.00313%樣品的培養(yǎng)液。再分別加入10 μL，108CFU/ mL的菌液，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，以相同樣品濃度的空白培養(yǎng)液做參比測(cè)定其在600 nm 的吸光度。與前一個(gè)低濃度的吸光度差兩個(gè)數(shù)量級(jí)并且培養(yǎng)液澄清透明所對(duì)應(yīng)的樣品濃度即為最低抑菌濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

圖1 O-季銨化-N-呋喃亞甲基殼聚糖的合成

1.5.2 抑菌率的測(cè)定

按照作者課題組的方法[11]，在1.2 mL的pH值7.2培養(yǎng)基中加入0.8 mL樣品溶液，同時(shí)分別加入大腸桿菌和金黃色葡萄球菌配成菌種濃度為 105～106CFU/mL的溶液，以10mL不加樣品的空白培養(yǎng)基為對(duì)照。在37 ℃搖床中將大腸桿菌培養(yǎng)1 h，金黃色葡萄球菌培養(yǎng)0.5 h。分別取25 μL培養(yǎng)液均勻涂到控制板和樣品板的瓊脂培養(yǎng)基上，在恒溫 37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，數(shù)出培養(yǎng)皿上的菌落數(shù)。按式（1）計(jì)算抑菌率。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物的FTIR分析

采用KBr壓片法測(cè)得原料及產(chǎn)物的FTIR如圖2。其中，a 為殼聚糖的紅外吸收譜線(xiàn)，b為O-季銨化-N-苯亞甲基殼聚糖席夫堿的吸收譜線(xiàn)[O-HTCC（BA）]，與a相比，b在1614 cm?1處的伯胺N—H彎曲峰消失，說(shuō)明在—NH2發(fā)生了取代。并且在1588 cm?1處出現(xiàn)苯環(huán)C—C骨架吸收峰，880 cm?1附近出現(xiàn)苯環(huán)的單取代吸收峰，1640 cm?1附近吸收峰強(qiáng)度增大并且發(fā)生紅移現(xiàn)象，表明C=N伸縮峰與酰胺吸收峰重疊[7]，1500 cm?1附近出現(xiàn)季銨鹽的CH2、CH3彎曲振動(dòng)峰，950～1000 cm?1間出現(xiàn)的峰為季銨鹽吸收峰[8]，由FTIR說(shuō)明產(chǎn)物為O-HTCC（BA）。c為 O-季銨化殼聚糖（O-HTCC）吸收譜線(xiàn)，與b相比，表征苯環(huán)的1580 cm?1和880 cm?1吸收峰基本消失，說(shuō)明苯甲基已從氨基脫除，只有極少殘余。d為O-季銨化-N-呋喃亞甲基殼聚糖席夫堿[O-HTCC（FF）]的吸收譜線(xiàn)，與c相比，910和757 cm?1出現(xiàn)呋喃環(huán)的特征峰[12]，1500 cm?1處的峰增強(qiáng)說(shuō)明呋喃骨架伸縮峰與季銨鹽的CH2、CH3彎曲峰重疊，并且1614 cm?1處的伯胺N—H彎曲峰消失，說(shuō)明呋喃環(huán)接枝在—NH2上。e為O-季銨化-N-呋喃亞甲基殼聚糖（O-FHTCC）的吸收譜線(xiàn)，與d相比，1640 cm?1附近的C=N伸縮峰大幅減弱。說(shuō)明產(chǎn)物為 O-HTCC（FF）被還原后的目標(biāo)產(chǎn)物O-FHTCC。

2.2 產(chǎn)物的1H NMR分析

圖2 原料及產(chǎn)物的FTIR譜圖

以D2O為溶劑，測(cè)得O-季銨化-N-呋喃亞甲基殼聚糖席夫堿[O-HTCC(FF)]和 O-季銨化-N-呋喃亞甲基殼聚糖（O-FHTCC）的1H NMR譜圖，如圖3和圖4所示。圖3和圖4中δ4.4～3.4為殼聚糖骨架的 H1，H2，H3，H4，H5，H6，H6'相對(duì)應(yīng)的質(zhì)子峰，δ=3.3附近為殼聚糖季銨鹽N上的甲基質(zhì)子峰[4]。圖3中δ7.5～7.3、δ6.4～6.3為呋喃亞甲基席夫堿結(jié)構(gòu)的質(zhì)子峰，說(shuō)明產(chǎn)物為O-HTCC（FF）。圖4中δ2.8說(shuō)明產(chǎn)物具有芳環(huán)結(jié)構(gòu)（呋喃環(huán)具有芳環(huán)性質(zhì)）[13]，同時(shí)δ7.4、δ6.4～6.2為呋喃亞甲基質(zhì)子吸收峰。

圖3 O-HTCC(FF)的 1H NMR譜圖

圖4 O-FHTCC的 1H NMR譜圖

2.3 產(chǎn)物的元素分析及取代度

產(chǎn)物的元素分析結(jié)果見(jiàn)表1，用C/N比計(jì)算各產(chǎn)物的取代度[14]。結(jié)果殼聚糖的脫乙酰度為84.32%，O-HTCC(BA)的N-苯亞甲基席夫堿取代度為76.14%，O-HTCC的季銨化取代度為46.35%，O-HTCC（FF）的 N-呋喃亞甲基席夫堿取代度為23.17%，O-FHTCC的 N-呋喃亞甲基取代度為23.17%。

2.4 產(chǎn)物的熱重分析

在N2保護(hù)下，以10 ℃/min的速率升溫，測(cè)定25～800 ℃范圍產(chǎn)物的 TG，結(jié)果如圖 5所示。在100 ℃以下3種產(chǎn)物均有失重現(xiàn)象出現(xiàn)，這是樣品中的結(jié)晶水和自由水丟失所致。在 220～280 ℃范圍3種產(chǎn)物的失重可能是殼聚糖的主鏈及側(cè)鏈發(fā)生了降解[9]。由 TG曲線(xiàn)可以看出 O-HTCC(BA)的熱穩(wěn)定性大于 O-HTCC(FF)，這是因?yàn)楸江h(huán)中鍵長(zhǎng)完全平均化，而作為五元雜環(huán)的呋喃環(huán)鍵長(zhǎng)只有一定程度的平均化，因此苯環(huán)共軛體系穩(wěn)定性大于呋喃環(huán)共軛體系[15]。而 O-FHTCC的熱穩(wěn)定性大于O-HTCC(BA)和O-FHTCC，是因?yàn)镃—N鍵的穩(wěn)定性大于C=N鍵。終產(chǎn)物O-FHTCC在200 ℃以下能穩(wěn)定存在。

表1 產(chǎn)物的元素分析及取代度

圖5 產(chǎn)物的TG圖

2.5 產(chǎn)物的溶解性試驗(yàn)

稱(chēng)取 0.1 g 的殼聚糖、N-苯亞甲基殼聚糖席夫堿、O-季銨化-N-苯亞甲基殼聚糖席夫堿、O-季銨化殼聚糖、O-季銨化-N-呋喃亞甲基殼聚糖席夫堿、O-季銨化-N-呋喃亞甲基殼聚糖分別于10 mL丙酮、氯仿、THF、2%乙酸等常見(jiàn)有機(jī)溶劑及水中，觀察其溶解性能。結(jié)果，CS（BA）、O-HTCC（BA）、O-HTCC、O-HTCC（FF）、O-FHTCC 均不溶于常見(jiàn)有機(jī)溶劑中。而季銨化改性殼聚糖O-HTCC及呋喃雜環(huán)改性季銨化殼聚糖O-HTCC（FF）、O-FHTCC均能溶于水，這為產(chǎn)物在抗菌等方面的應(yīng)用提供了可能性。

表3 產(chǎn)物對(duì)E. coli和S. auresus的MIC值 單位：μg/mL

2.6 產(chǎn)物的抗菌性能試驗(yàn)

2.6.1 最低抑菌濃度測(cè)定

按照實(shí)驗(yàn)部分1.5.1節(jié)的操作，測(cè)得各產(chǎn)物的最低抑菌濃度（MIC）見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)，各合成產(chǎn)物均具有一定的抗菌效果，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌S. aureus的抗菌活性比革蘭氏陰性菌E. coil更強(qiáng)，并且在pH值 5.5的抗菌效果優(yōu)于pH值 7.2，這與作者課題組前面的研究結(jié)果一致[11]。由表 3可以看出，抗菌活性順序?yàn)?O-季銨化-N-呋喃亞甲基殼聚糖（O-FHTCC）＞O-季銨化-N-呋喃亞甲基殼聚糖席夫堿[O-HTCC(FF)]＞ O-季銨化-N-苯亞甲基殼聚糖席夫堿[O-HTCC(BA)]＞O-季銨化殼聚糖(O-HTCC)。O-FHTCC抗菌效果優(yōu)于O-HTCC（FF），并明顯優(yōu)于其他二種殼聚糖衍生物O-HTCC（BA）和O-HTCC。此研究結(jié)果表明：含呋喃雜環(huán)的殼聚糖衍生物的抗菌活性明顯優(yōu)于不含雜環(huán)的殼聚糖衍生物。

O-FHTCC和 O-HTCC（FF）的抗菌效果明顯優(yōu)于O-HTCC和O-HTCC（BA），可能是由于呋喃環(huán)能夠在微生物細(xì)胞膜和細(xì)胞壁附近以協(xié)同作用選擇性的螯合對(duì)微生物（菌類(lèi)）生長(zhǎng)起關(guān)鍵作用的金屬離子（銅、鐵和鋅等），從而降低細(xì)胞膜合成酶的活性，起到破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的作用，從而提高了抑菌效果[16-17]。O-FHTCC抗菌效果優(yōu)于O-HTCC（FF），可能是由于O-HTCC（FF）的C=N鍵與呋喃環(huán)形成共軛體系，一定程度上影響了呋喃雜環(huán)的電子分布，從而影響呋喃環(huán)的螯合作用，故其抗菌效果不如O-FHTCC。

2.6.2 產(chǎn)物的抑菌率測(cè)定

按照實(shí)驗(yàn)部分1.5.2節(jié)的操作，用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定0.1%樣品溶液在pH值 7.0下對(duì)E. coli（作用時(shí)間1 h）和 S. Aureus（作用時(shí)間0.5 h）的抑菌率，結(jié)果如圖6所示。由圖6可見(jiàn)，各產(chǎn)物對(duì)E. coli和S. aureus都有較好的抑制作用，并且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌S. aureus的抗菌效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌E. coli。抗菌效果為O-FHTCC＞ O-HTCC（FF）＞ O-HTCC（BA）＞ O-HTCC。與最低抑菌濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖6 產(chǎn)物對(duì)E. coli和S. aureus的抑菌率

3 結(jié) 論

制備了 O-季銨化-N-呋喃亞甲基殼聚糖席夫堿和 O-季銨化-N-呋喃亞甲基殼聚糖兩種新型含呋喃雜環(huán)的水溶性殼聚糖衍生物。抗菌試驗(yàn)表明，產(chǎn)物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌S.aureus的抗菌效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌 E.coli，在 pH值 5.5的抗菌效果優(yōu)于 pH值7.2。抗菌活性順序?yàn)镺-FHTCC＞ O-HTCC（FF）＞O-HTCC（BA）＞ O-HTCC。研究表明：含呋喃雜環(huán)的殼聚糖衍生物的抗菌活性明顯優(yōu)于不含雜環(huán)的殼聚糖衍生物。為殼聚糖衍生物在生物醫(yī)用抗菌領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

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