抑制miR-886-5p表達對SiHa細胞侵襲的影響

王建新 馬翠花

宮頸癌為婦科常見惡性腫瘤之一，其發病率近年來呈上升趨勢，嚴重威脅女性的生命健康，受到全世界的廣泛關注［1］。雖然已知宮頸癌的發病與人乳頭瘤病毒(HPV)感染有關，但是腫瘤的形成機制仍未完全闡明。近些年一類新的非蛋白編碼microRNAs(miRNAs)的出現，為腫瘤研究提供了新的思路。miRNAs是一類長約21～24個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，在調節細胞增值，凋亡以及腫瘤的發生過程中起了很重要的作用［2，3］。有研究發現 miR-886-5p在宮頸癌的含量明顯高于癌周及癌旁組織［4］。本實驗通過下調人宮頸癌SiHa細胞miR-886-5p的表達，采用Transwell侵襲實驗研究miR-886-5p在SiHa細胞中的生物學行為，為宮頸癌的診治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 宮頸癌SiHa細胞購自協和醫科大學基礎醫學研究所。帶有GFP標簽的抑制miR-886-5p表達及對照質粒(miR-886-5p inhibitors/NC)均來自中國吉瑪公司。主要試劑:DMEM培養基購自GIBCO公司，三氯甲烷、異丙醇和無水乙醇均購自北京化學試劑公司，TRIzol試劑，MML-V試劑盒和 LipofectamineTM2000均為美國 Invitrogen公司產品，質粒小量提取試劑盒購自博大泰克公司，SYBR Premix Ex Taq試劑購自TakaRa公司，PCR擴增引物的合成與 DNA測序均由上海生工公司完成。Transwell?及培養皿均購自Corning公司，Matrigel購自BD公司。

1.2 細胞培養與轉染 SiHa細胞培養于含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培養基內，每3天換液1次，0.25% 胰酶消化傳代，倒置顯微鏡下觀察。在轉染前1天用12孔板接種細胞，每孔5×105個細胞，培養過夜，待轉染帶有GFP標簽的miR-886-5p inhibitor/NC質粒，每組3個復孔。細胞長滿60%培養孔底時，用不含血清的DMEM各500 μl分別稀釋2 μg待轉染質粒和5 μl LiPofectamine 2000 轉染試劑，室溫放置5 min后，將兩者混合作用20 min形成DNA-脂質體復合物。分別將1 ml帶有miR-886-5p inhibitor/NC質粒的DNA-脂質體復合物加入各培養孔，輕輕搖勻，37℃、5%CO2、飽和濕度下培養過夜。

1.3 轉染細胞的篩選 細胞轉染24 h后，加入5 μg/ml Blasticidin進行篩選，每5天換液1次，直到長出細胞克隆，在顯微鏡下用胰酶消化，挑出克隆，移至10cm細胞培養皿繼續用Blasticidin篩選液培養。3～4周后，熒光倒置顯微鏡下觀察表達GFP的陽性克隆，再次用胰酶消化，挑出陽性克隆并用1 μg/ml Blasticidin篩選液大量培養。

1.4 實時定量PCR檢測抑制水平 按產品說明書，用TRIzol提取細胞總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳監測RNA質量。用M-MLV反轉錄酶將1 μg總RNA反轉錄為cDNA，保存于－80℃待用。使用ABI 7500 PCR儀，以hs-U6作為內參，進行實時定量PCR反應檢測miRNA的表達，反應包括40個循環(95℃，30 s;60℃，1 min)，每次設立3個復孔。特異性miR-886-5p的上下游引物分別為5’-CGGGTCGGAGTTAGCTCA-3’和5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;U6 snRNA 的上下游引物分別為5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’和5’-GGAACGCTTCACGA-ATTTG-3’。其擴增曲線和融解曲線說明引物具有很好的特異性，將擴增產物進行DNA測序分析進一步證實擴增特異性。采用ΔΔCt法分析基因的表達水平［5］，即 RQ=2-ΔΔCt，［ΔΔCt=(CtmiRNA–CtU6)樣品-(CtmiRNA–CtU6)校正樣品］。每次實驗包括以水為模板的陰性對照，根據(2-ΔΔCT)計算每對樣本的相對表達量。

1.5 Matrigel體外細胞侵襲實驗 對數生長期的各組細胞經PBS洗滌后，用0.25%胰酶消化制備成無血清DMEM單細胞懸液，調整細胞密度為5×104/ml。BD Matrigel TM Invasion Chamber結構包括上室和下室兩個部分，上室已經鋪好凝膠化的Matrigel基質，該物質模仿人體內的基底膜結構，膠的下方有一層PET膜，上面有許多直徑8 μm的微孔，細胞根據其不同的侵襲能力突破基質膠后從小孔中穿過至PET膜的底面。上室加入100 μl無血清DMEM細胞懸液，下室加入650 μl含5%血清的DMEM培養基，將小室提起，去除氣泡后，置37℃、5%CO2細胞孵箱溫育12 h后，用棉簽抹去上室上表面細胞和Matrigel凝膠后，用PBS洗滌5次，用10%的甲醇固定上室下表面細胞10 min，用10 μg/ml的DAPI染色1 min后于倒置顯微鏡下，每孔隨機取3個視野計數后取平均值，重復實驗3次進行統計學分析。

1.6 統計學分析 應用SPSS 11.5統計軟件，計量資料以表示，雙尾t檢驗用于2組獨立樣本之間差異的比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 轉染后miR-886-5p的表達水平 應用實時熒光定量PCR檢測轉染后表達抑制組和對照組細胞中miR-886-5p的表達水平，表達抑制組明顯低于對照組(P ＜0.05)。見圖1。

圖1 篩選穩定克隆后SiHa細胞中miR-886-5p的表達水平(U6snRNA為內參，*P ＜0.05，n=3)

2.2 miR-886-5p對宮頸癌SiHa細胞侵襲能力的影響 在顯微鏡下觀察Matrigel體外侵襲實驗結果，計數上室PET膜下表面穿出的細胞個數(焦距100×)，每組細胞每次隨機計數10個視野取平均值為穿膜細胞均數。分別為Mock組穿膜細胞均數，穩轉miR-886-5p inhibitor對照質粒穿膜細胞均數，穩轉miR-886-5p inhibitor質粒穿膜細胞均數。差異有統計學意義(P＜0.05)。上述結果說明，穩定轉染miR-886-5p inhibitor質粒的SiHa細胞其體外侵襲能力比未轉染質粒及轉染對照質粒組細胞均明顯減弱。見圖2。

圖2 miR-886-5p對宮頸癌SiHa細胞侵襲能力的影響。A Matrigel侵襲實驗分析SiHa細胞穩轉miR-886-5p抑制質粒及其陰性對照質粒后的侵襲能力，侵襲膜下表面細胞DAPI染色后熒光倒置顯微鏡下觀察結果(焦距100×);B鏡下侵襲膜下表面細胞計數結果統計，數據用Mean±SD表示(*P ＜0.01，n=10)

3 討論

miRNA作為生物體重要的基因調控分子，在多種惡性腫瘤組織中的表達與正常組織中存在顯著差異，miRNA的紊亂表達可引起組織細胞的惡性轉化，參與腫瘤的發生發展［6］。宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病與高危型人乳頭瘤狀病毒(HPV)的感染密切相關，但是感染后確切的分子機制仍不清楚。近來，與宮頸癌細胞的增殖、轉移、凋亡密切相關的miRNA已逐漸引起人們的關注［7］。miRNA表達分析顯示，miR-143、miR-145顯著下調，能夠抑制細胞生長，與腫瘤發生相關;miR-146a顯著上調，具有促進細胞增殖的能力［8］。Iorio等［9］利用以 PCR 為基礎的已建立的miRNA檢測分析102例宮頸癌樣本，發現miR-200a能夠抑制宮頸癌細胞南上皮層向肌層侵襲，miR-200a過表達明顯減少了宮頸癌細胞擴散轉移。本研究結果表明，下調miR-886-5p可顯著抑制SiHa細胞的侵襲能力。由此，我們初步推測miR-886-5p在宮頸癌中可能發揮癌基因的作用，提示靶向抑制miR-886-5p為宮頸癌的治療提供了新思路。

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4 Li J-H，Xiao Xue，Zhang Y-N，et al.MicroRNA miR-886-5p inhibits apoptosis by down regulating Bax expression in human cervical carcinoma cells.Gynecologic Oncology，2011，120:145-151.

5 Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(Delta Delta C(T))method.Methods，2001，25:402-408.

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8 Wang X，Tang S，Le SY，et al.Aberrant expression of oncogenic and tumor-suppressive microRNAs in cervical cancer is required for cancer cell growth.PLoS ONE，2008，3:e2557.

9 Iorio MV，Visone R，Di Leva G，et al.MicroRNA signatures in human ovarian cancer.Cancer Res，2007，67:8699-8707.