結(jié)直腸癌中Ezrin的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

姚冬穎 許欣 趙振亞

結(jié)直腸癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率及死亡率均有明顯上升的趨勢［1］。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤重要的生物學(xué)行為和致死因素。埃茲蛋白(Ezrin蛋白)是新近發(fā)現(xiàn)且備受關(guān)注的腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，研究發(fā)現(xiàn)其參與多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。本研究通過免疫組化方法檢測結(jié)直腸癌中的Ezrin蛋白的表達(dá)情況，探討其在結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，為臨床診斷、治療和預(yù)后判斷提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院2006年1月至2007年12月期間手術(shù)切除且臨床病理及隨訪資料完整的結(jié)直腸癌標(biāo)本120例，所有患者術(shù)前均未接受化療、放療和免疫治療。男64例，女56例;年齡39～82歲，平均年齡59歲;腫物位于結(jié)腸54例，位于直腸66例;腫瘤最大直徑＜5cm者44例，＞5cm者76例;高-中分化73例，低分化47例;侵犯深度未侵及漿膜35例，侵及漿膜85例;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的78例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的42例;Dukes分期A+B期68例，C+D期52例。同時(shí)取正常結(jié)直腸黏膜組織20例作為對照。所有標(biāo)本均采用常規(guī)取材，經(jīng)10%中性緩沖甲醛液固定，石蠟包埋，做4 μm厚連續(xù)切片，做HE及免疫組化染色。

1.2 方法 應(yīng)用免疫組vision兩步法，鼠抗人Ezrin單克隆抗體(工作液)及免疫組化試劑盒均購于福州邁新生物技術(shù)有限公司。切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液中高溫修復(fù)抗原15 min，室溫下自然冷卻，3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性10 min，滴加一抗，濕盒內(nèi)4℃過夜，滴加聚合物增強(qiáng)劑，滴加酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物，DAB顯色。以試劑公司提供的陽性切片作陽性對照，PBS(磷酸鹽緩沖液)代替一抗作陰性對照，每例都有HE切片作為對照觀察。免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)Ezrin蛋白陽性定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，依據(jù)細(xì)胞顯色的有無及深淺，按雙評(píng)分化Eli半定量方法判斷。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)不同高倍鏡視野(400×)，每高倍視野計(jì)數(shù)200個(gè)瘤細(xì)胞，先依據(jù)顯色深淺評(píng)分:0分，無顯色;1分，淺黃色;2分，棕黃色;3分，棕褐色。再依據(jù)顯色比例評(píng)分:1分，顯色細(xì)胞＜25%;2分，顯色細(xì)胞25% ～50%;3分，顯色細(xì)胞 51% ～75%;4分，顯色細(xì)胞＞75%。最后以兩者乘積的得分值作為判定標(biāo)準(zhǔn):0～4分為陰性表達(dá)，5分以上為陽性表達(dá)［2］。以上結(jié)果由兩位病理科醫(yī)生在雙盲情況下觀察確定。

1.3 隨訪 對120例患者進(jìn)行隨訪獲取生存或死亡信息，生存時(shí)間按月計(jì)算，以手術(shù)日至末次隨訪所得的時(shí)間為準(zhǔn)。本組患者死亡82例，結(jié)尾38例，生存時(shí)間為22～79個(gè)月，中位生存時(shí)間為59個(gè)月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，不同組織類型中蛋白表達(dá)的關(guān)系、結(jié)直腸癌組織中Ezrin蛋白的表達(dá)與臨床病理之間的關(guān)系比較采用χ2檢驗(yàn)，生存率的比較用kaplan-Meier生存曲線，Log-rank檢驗(yàn)，Cox多因素分析篩選影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ezrin蛋白在結(jié)直腸癌組織和正常結(jié)直腸組織中的表達(dá) Ezrin蛋白在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒分布，細(xì)胞膜也有部分著色。在120例結(jié)直腸癌組織中有74例呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為61.7%，20例正常結(jié)直腸黏膜中僅4例呈陽性表達(dá)，陽性率為20.0%，2組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。見表1，圖1、2。

2.2 結(jié)直腸癌組織中Ezrin蛋白的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 Ezrin蛋白的表達(dá)與分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期密切相關(guān)(P ＜0.05)，與性別、年齡、腫瘤部位和大小無關(guān)(P ＞0.05)。見表2。

表1 Ezrin蛋白在不同大腸組織中的表達(dá) 例(%)

圖1 Ezrin蛋白在正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)(IHC×200)

圖2 Ezrin蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)(IHC×200)

表2 Ezrin蛋白的表達(dá)與大腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 例(%)

2.3 結(jié)直腸癌組織中Ezrin蛋白的表達(dá)與生存期的關(guān)系 Ezrin蛋白陽性表達(dá)患者5年生存率為35.1%，中位生存時(shí)間為42個(gè)月，Ezrin蛋白陰性表達(dá)患者5年生存率為73.9%，中位生存時(shí)間為69個(gè)月。繪制kaplan-Meier生存曲線，生存率的比較經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，Ezrin蛋白的陽性表達(dá)組生存期顯著低于陰性組(χ2=28.106，P=0.000)。見圖3。

圖3 結(jié)直腸癌組織中Ezrin陽性表達(dá)組和陰性表達(dá)組累積生存曲線

2.4 影響生存期的Cox多因素分析 經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)篩選出對結(jié)直腸癌生存有影響的因素為分化程度(χ2=19.173，P=0.000)、浸潤深度(χ2=16.120，P=0.000)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=111.646，P=0.000)、Dukes分期(χ2=122.834，P=0.000)和 Ezrin 的表達(dá)情況(χ2=28.106，P=0.000)。再進(jìn)行 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析，結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.019)、Dukes分期(P=0.000)及 Ezrin 的表達(dá)(P=0.010)為影響結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表3。

表3 預(yù)后相關(guān)因素的Cox回歸多因素分析

3 討論

惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是威脅生命的主要原因。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)包含復(fù)雜步驟的過程，癌細(xì)胞需經(jīng)歷從原發(fā)灶脫落、細(xì)胞粘附于基質(zhì)、蛋白水解酶降解基質(zhì)等向周圍組織侵襲或進(jìn)入淋巴系統(tǒng)而進(jìn)一步向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移Ezrin是ERM家族成員，編碼的基因是Villin2，人類定位于染色體6q25.2～q26，mRNA全長3166 bp，編碼585個(gè)氨基酸。該家族包括Ezrin、Redixin、Moesin、Merlin四種結(jié)夠相近的蛋白，在調(diào)節(jié)細(xì)胞形狀、生長、運(yùn)動(dòng)、粘附力、信號(hào)傳導(dǎo)等活動(dòng)中發(fā)揮作用。主要由三個(gè)結(jié)構(gòu)域組成:氨基末端、螺旋區(qū)、羥基末端。Ezrin通過參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)整細(xì)胞間粘附分子及細(xì)胞骨架連接等途徑，影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為［3，4］。已有報(bào)道，Ezrin 蛋白在食管癌［5］、乳腺癌［6］、骨肉瘤［7］等多種惡性腫瘤中高表達(dá)，是預(yù)后不良的分子標(biāo)志物。

我們的研究結(jié)果顯示，Ezrin蛋白在結(jié)直腸癌組織中的陽性表達(dá)顯著高于正常組織，提示Ezrin蛋白的表達(dá)可能對結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展發(fā)揮了促進(jìn)作用。本研究還顯示，Ezrin蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌的分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期密切相關(guān)，且其表達(dá)水平隨腫瘤分化的降低、浸潤深度的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生及臨床分期的進(jìn)展逐漸升高，提示Ezrin蛋白表達(dá)上調(diào)可能參與了結(jié)直腸癌的惡性演變過程，Ezrin蛋白高表達(dá)的結(jié)直腸癌有較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移傾向。這一結(jié)果與李宏偉等［8］的研究結(jié)果一致。手術(shù)后對患者進(jìn)行長期隨訪進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)Ezrin蛋白的陽性表達(dá)組生存期顯著低于陰性組。Cox多因素分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期及Ezrin的表達(dá)為影響結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立因素。由此可見，檢測Ezrin蛋白的表達(dá)情況可作為判斷結(jié)直腸癌侵襲程度和評(píng)估患者生存期的可靠指標(biāo)。

綜上所述，Ezrin蛋白的異常表達(dá)貫穿于結(jié)直腸癌的早期發(fā)生到晚期轉(zhuǎn)移的全過程，Ezrin蛋白可能成為評(píng)估患者預(yù)后和生存時(shí)間的指標(biāo)之一，并為基因治療提供新的靶點(diǎn)。

1 宋曉昕.Fascin、β-catenin、E-cadherin在大腸管狀腺瘤癌變過程中的表達(dá)及意義.河北醫(yī)藥，2010，32:2178-2180.

2 劉曄，楊靜，李輝，等.Ezrin和CD44V6在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2009，25:143-146.

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4 Ho Won Lee，Eui Han Kim，Mee-Hye Oh.Clinicopathologic Implication of Ezrin Expression in Non-small Cell Lung.Cancer Korean J Pathol，2012，46:470-477.

5 Xie JJ，Xu LY，Wu ZY，et al.Prognostic implication of ezrin expression in esophageal squamous cell carcinoma.J Surg Oncol，2011，104:538-543.

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7 Kim C，Shin E，Hong S，et al.Clinical value of ezrin expression in primary osteosarcoma.Cancer Res Treat，2009，41:138-144.

8 李宏偉，許若飛，王鐵山，等.結(jié)直腸癌組織中Ezrin蛋白的表達(dá)及其臨床意義.中國現(xiàn)代普通外科進(jìn)展，2012，15:102-104.