補陽還五湯對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細胞凋亡和Caspase-3基因表達的影響

任巖 曹余恒 李杰萍

腦梗死是神經(jīng)系統(tǒng)的多發(fā)病，約占急性腦血管病的70%~80%，有較高的病死率和致殘率，凋亡是腦缺血的神經(jīng)細胞損傷的重要機制之一。近來研究表明，Caspase-3在各種因素啟動的凋亡程序中起重要的樞紐作用。補陽還五湯為《醫(yī)林改錯》中的成方，由黃芪、歸尾、赤芍、地龍、川芎、桃仁、紅花七味藥組成，具有補氣活血、疏通經(jīng)絡(luò)的功效，是近代醫(yī)家用于治療中風(fēng)的常用方劑之一。本實驗應(yīng)用大鼠腦缺血再灌注（MCAO/R）模型，經(jīng)腹腔注射補陽還五湯，研究補陽還五湯對神經(jīng)細胞凋亡和Caspase-3表達的影響，討論其在腦缺血再灌注損傷中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 補陽還五湯成分為黃芪60 g，赤芍10 g，川芎10 g，全當(dāng)歸10 g，干地龍10 g，紅花10 g，桃仁10 g，藥材購自煙臺市市直機關(guān)醫(yī)院藥劑科并經(jīng)鑒定，按本室方法制備濃度為1.5 g/mL的水煎醇提液。具體步驟如下：（1）將生藥浸入10 倍體積的蒸餾水浸泡2 h；（2）煮沸后文火煎1 h，過濾；（3）再加10倍體積的蒸餾水，煮沸后文火煎1 h，過濾；（4）重復(fù)步驟（3）；（5）將以上3次過濾液合并，濃縮成濃度為100%藥液，過濾；（6）置于磁力攪拌器上，邊攪拌邊加入3 倍量無水乙醇，繼續(xù)攪拌過夜；（7）過濾，2000 rpm/min離心30 min，取上清液；（8）上清液揮發(fā)盡乙醇，制成濃度為1.5 g/mL的溶液；（9）高壓滅菌后，4 ℃保存。

1.2 制作動物模型 隨機選擇SPF級成年雌性Wistar大鼠40只（體重230~250 g），由煙臺市濱州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。首先將實驗動物放置于實驗室內(nèi)1周，保持自由進食和飲水，維持室溫恒定。手術(shù)前12小時開始禁食。隨機選擇30只動物，按照線栓法（經(jīng)左側(cè)頸外-頸內(nèi)動脈插線）建立腦缺血2 h后再灌注22 h的動物模型，術(shù)后2 h對模型是否成功進行評估，評估標(biāo)準(zhǔn)為出現(xiàn)左側(cè)Horner征、提尾時右前肢屈曲、爬行時向右側(cè)劃圈行為。將20只成功建立腦缺血再灌注模型的大鼠隨機平均分為陰性對照組和補陽還五湯治療組。剩余10只未做模型的大鼠作為假手術(shù)組，假手術(shù)組動物僅在左側(cè)頸內(nèi)動脈插線后隨即將線抽出。實驗過程中及術(shù)后狀態(tài)不佳的動物棄去不用，另取動物補充。

1.3 用藥干預(yù)處理 治療組動物在栓塞2 h后再灌注前以腹腔注射給予補陽還五湯（每公斤體重給予16 g），假手術(shù)組和陰性對照組動物腹腔注射等量的0.1 mol/L PBS緩沖液。

1.4 神經(jīng)功能評分 再灌注22 h后對三組動物的神經(jīng)功能進行評分。3分：栓塞對側(cè)前肢屈曲，栓塞對側(cè)肩部抵抗減弱，且自由活動時有劃圈表現(xiàn)；1分：栓塞對側(cè)前肢屈曲，肩部抵抗減弱，但無劃圈；0分：無神經(jīng)功能異常癥狀。

1.5 制備石蠟切片 每組隨機選取5只大鼠，水合氯醛麻醉，仰臥位固定后，0.9%氯化鈉心臟灌注，然后用4%甲醛心臟灌注，將鼠腦取出，置于4%甲醛溶液中再固定2 h，蒸餾水浸泡4 h，常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。冠狀位切片。

1.6 細胞凋亡檢測 將石蠟切片脫蠟水化，用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（Santa Cruz公司）進行操作，在熒光顯微鏡下用藍色激發(fā)光照射，在高倍鏡下在皮質(zhì)、紋狀體、海馬區(qū)隨機各取5個視野計數(shù)發(fā)出黃綠色熒光的陽性細胞。

1.7 免疫組化檢測 將石蠟切片脫蠟水化，用即用型SABC免疫組化試劑盒試劑盒進行操作（兔抗鼠Caspase-3抗體由Santa Cruz公司提供），DAB顯色（DAB染液由武漢博士德生物公司提供），用LEICA Qwin圖像處理系統(tǒng)分析皮質(zhì)、紋狀體和海馬區(qū)各5個視野的吸光度值（A）。

1.8 酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測 每組隨機選取5只大鼠，腹腔麻醉后，仰臥位固定，生理鹽水心臟灌注，取出鼠腦，將其放置于液氮中快速冷凍。用超聲粉碎器將鼠腦制成腦組織勻漿，離心后取上清。用ELISA試劑盒（購于BG公司）檢測腦組織勻漿中的Caspas-3含量。使用酶標(biāo)儀（450 nm）測OD值，繪制以O(shè)D值為縱坐標(biāo)、以標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)樣品的OD值查其在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的濃度（單位：μg/L）。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 11.5版本統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以（s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分 假手術(shù)組術(shù)后神經(jīng)功能無異常，評分為0分。陰性對照組評分（2.25±0.34）分，顯著高于假手術(shù)組0分（P<0.05）。補陽還五湯組評分（1.28±0.38）分，顯著低于陰性對照組（P<0.05）。

2.2 凋亡陽性細胞數(shù) 假手術(shù)組腦組織切片僅觀察到散在分布的少量凋亡細胞，陰性對照組凋亡細胞數(shù)顯著增多，陽性細胞主要分布于皮質(zhì)、紋狀體、海馬。補陽還五湯組凋亡細胞數(shù)顯著低于陰性對照組（P<0.05）。見表 1。

表1 三組凋亡陽性細胞數(shù)比較（s）

表1 三組凋亡陽性細胞數(shù)比較（s）

*與假手術(shù)組同區(qū)域比較，P<0.05；Δ與陰性對照組同區(qū)域比較，P<0.05

組別 皮質(zhì)區(qū) 紋狀體區(qū) 海馬區(qū)假手術(shù)組（n=5）3.57±1.25 3.11±1.65 2.32±1.88陰性對照組（n=5）19.54±3.39* 16.35±2.77* 13.69±2.38*補陽還五湯組（n=5）8.94±2.25Δ 7.73±2.16Δ 6.20±1.67Δ

2.3 Caspase-3表達 皮質(zhì)、紋狀體和海馬三區(qū)的Caspase-3吸光度值（A）無顯著差異，故將三區(qū)數(shù)據(jù)合并統(tǒng)計。假手術(shù)組Caspase-3表達微弱，陰性對照組Caspase-3吸光度值（A）顯著高于假手術(shù)組（P<0.05）。補陽還五湯組Caspase-3表達顯著低于陰性對照組（P<0.05）。見表2。

2.4 Caspase-3濃度檢測 假手術(shù)組腦組織勻漿中Caspase-3含量很低，而陰性對照組明顯上升。補陽還五湯組Caspase-3含量顯著低于陰性對照組（P<0.05）。見表2。

表2 三組Caspase-3吸光度值和定量檢測比較（s）

表2 三組Caspase-3吸光度值和定量檢測比較（s）

*與假手術(shù)組比較，P<0.05；Δ與陰性對照組比較，P<0.05

組別 吸光度值（A）濃度（μg/L）假手術(shù)組（n=5）0.19±0.09 15.48±2.66陽性對照組（n=5）0.67±0.20* 48.33±5.78*補陽還五湯組（n=5）0.25±0.13Δ 23.96±4.01Δ

3 討論

補陽還五湯是一劑補氣活血通絡(luò)的方藥，主治中風(fēng)后遺癥，如半身不遂、口眼歪斜、語言艱澀、遺尿不禁等。此方由清代名醫(yī)王清任創(chuàng)立，為后世醫(yī)家所推崇，沿用至今已一百多年。王氏認為，中風(fēng)的病機為氣虛血滯導(dǎo)致腦絡(luò)淤阻，氣虛為本，血瘀為標(biāo)，方劑中的君臣佐使各藥主要起補氣活血的作用。這是中醫(yī)中補陽還五湯的藥理機制。如今，隨著人們對腦中風(fēng)的病理機制的研究逐漸深化，腦缺血后細胞和分子水平的病理機制正在逐漸被揭示。

Nitatori T等人在上個世紀(jì)發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后，海馬CAl區(qū)出現(xiàn)遲發(fā)性神經(jīng)細胞死亡。目前已有大量研究都證實這種遲發(fā)性神經(jīng)元死亡與細胞凋亡關(guān)系密切，提示腦缺血的神經(jīng)細胞損傷不只是壞死，而且與凋亡密切相關(guān)。當(dāng)腦缺血再灌注發(fā)生之后，壞死和凋亡同時發(fā)生，壞死細胞主要集中在缺血中心區(qū)，而凋亡細胞主要集中在缺血周圍區(qū)。隨著再灌注時間加長，缺血周圍區(qū)的凋亡細胞數(shù)量會逐漸增加，到24 h達到高峰。這說明在腦缺血引發(fā)的細胞漸進死亡過程中，細胞凋亡是一種重要形式。所以，抗凋亡是腦缺血的一種必要的治療手段。

Caspase-3蛋白是參與凋亡過程的一種重要的蛋白質(zhì)。腦缺血時，Caspase-3蛋白表達也明顯升高，而且Caspase-3的表達與細胞凋亡的動態(tài)變化一致，兩者不僅在相同區(qū)域出現(xiàn)，并且?guī)缀跬瑫r達到高峰，因此Caspase-3與缺血性神經(jīng)元凋亡的關(guān)系非常密切。研究顯示，Caspase-3是介導(dǎo)凋亡的一種重要的蛋白酶，在腦缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用[1-2]。

筆者的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦缺血及再灌注模型組神經(jīng)元凋亡細胞和Caspase-3的表達明顯增多，補陽還五湯組神經(jīng)細胞的凋亡受到了抑制，并減少了Caspase-3的表達，從而證明了補陽還五湯治療中風(fēng)的機制與抗神經(jīng)元細胞凋亡有關(guān)，并且其抗凋亡的機制之一是通過調(diào)控Caspase-3基因表達實現(xiàn)的，但這種調(diào)控的分子機制以及是否同時合并其他的調(diào)控機制還有待進一步的研究。

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