丙泊酚對斑馬魚胚胎運動神經(jīng)元發(fā)育的影響

曹建斌 朱敏淑 曹東航 王明倉 李軍

丙泊酚是一種廣泛使用的麻醉藥，它具有起效快、代謝迅速，使用后患者蘇醒平穩(wěn)、不良反應(yīng)少等優(yōu)點，常用于嬰幼兒手術(shù)的麻醉。和其他常用的臨床麻醉藥一樣，丙泊酚的早期多次接觸會增加患兒術(shù)后多動癥、語言障礙、注意力缺陷和行為異常等風(fēng)險[1-2]；這些不良反應(yīng)癥狀中，很多可能涉及到運動神經(jīng)元功能的障礙。盡管丙泊酚對運動神經(jīng)元發(fā)育的影響尚未見報道，其潛在的風(fēng)險并不能忽視。所以，有必要設(shè)計和開展嚴密的科學(xué)實驗評估丙泊酚對運動神經(jīng)元發(fā)育的影響，以便于指導(dǎo)臨床醫(yī)生對患兒合理使用麻醉藥。斑馬魚是一種常見的模式脊椎動物，它具有體外受精、胚胎透明、易于遺傳操作等特點，因此常被用來觀察胚胎發(fā)育，包括運動神經(jīng)元發(fā)育[3]。斑馬魚的基因與人類的基因相似度很高，序列同源性高達87%[4]，所以斑馬魚也常用于臨床藥物研發(fā)與評估[5]。本研究利用標記運動神經(jīng)元的Tg（hlxb9:mGFP）轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，在活體上觀察丙泊酚對斑馬魚胚胎運動神經(jīng)元發(fā)育的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 轉(zhuǎn)基因斑馬魚為Tg（hlxb9:mGFP）品系，由中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所提供。按照Kimmel胚胎分類方法[6]進行實驗。將Tg（hlxb9:mGFP）品系斑馬魚飼養(yǎng)在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，飼養(yǎng)間保持在14h∶10h的亮暗循環(huán)中。在實驗前1d 21：00將發(fā)育成熟的轉(zhuǎn)基因斑馬魚按雌雄1∶1放入交配缸中（每缸共2條），并用擋板隔開。實驗當(dāng)日11：00拔去擋板，10min后收集胚胎，并將胚胎放入28.5℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗藥物為丙泊酚（中國費森尤斯卡比公司），二甲基亞砜（DMSO）、MS-222（美國Sigma-Aldrich公司）。

1.2 儀器 智能光照培養(yǎng)箱（多段編程GXZ型，中國寧波江南儀器廠），斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（中國愛生公司），Nikon SMZ 1000顯微鏡（日本尼康公司），F(xiàn)V-1000激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 分組與藥物處理 當(dāng)胚胎受精后8h（hpf），在顯微鏡下確定胚胎處于相同發(fā)育階段，選擇健康的受精卵轉(zhuǎn)入六孔板飼養(yǎng)，每孔放入30個胚胎并加入4ml魚房系統(tǒng)水。胚胎分為5組，并進行相應(yīng)的藥物處理：A組用20μg/ml丙泊酚處理組，B組用10μg/ml丙泊酚處理組，C組用5μg/ml丙泊酚處理組，D組用DMSO溶劑處理作為對照，E組不作任何處理（空白對照組）。各組藥物處理時間從8hpf持續(xù)至52hpf，結(jié)束后用系統(tǒng)水洗脫藥物3次，然后從各組中隨機取12個胚胎進行觀察分析各組胚胎整體發(fā)育狀況，取胚胎整體發(fā)育正常組的胚胎進行熒光共聚焦成像。

1.4 活體成像觀察 將各組斑馬魚胚胎先予0.03%MS-222麻醉3min，然后用1.5%低熔點膠對各組斑馬魚胚胎進行側(cè)躺固定包埋，以便拍照。待包埋胚胎的膠凝固冷卻后，在胚胎上方滴上1滴系統(tǒng)水浸沒胚胎，然后用激光共聚焦顯微鏡進行拍照，觀察斑馬魚軀干泄殖孔前方8個體節(jié)區(qū)域運動神經(jīng)元軸突生長情況，統(tǒng)計各組每條斑馬魚該節(jié)段未長出突起的運動神經(jīng)元比例。按照斑馬魚運動神經(jīng)元突起的缺失程度進行分類[3]，缺失比例＞80%為重度缺失，缺失比例＜20%為正常，其余為中度缺失。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism v6.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示，組間比較采用非配對雙尾t檢驗；計數(shù)資料采用頻率（百分率）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對斑馬魚整體發(fā)育的影響 結(jié)果表明，A組、B組斑馬魚胚胎形態(tài)停滯在原腸胚時期，說明該濃度的丙泊酚有明顯的胚胎毒性。發(fā)育正常的胚胎比例C組為（78.9±7.0）%，D 組為（84.4±5.1）%，E 組為（87.9±7.0）%，C組與D組、E組發(fā)育正常的胚胎比例比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），說明5μg/ml丙泊酚處理不會對斑馬魚的整體發(fā)育狀況造成明顯的影響，因此，本研究可用這一藥物濃度處理的斑馬魚來評估丙泊酚對運動神經(jīng)元發(fā)育的特異影響。

2.2 丙泊酚對運動神經(jīng)元發(fā)育的影響 不同胚胎的運動神經(jīng)元突起生長情況不盡相同，有的胚胎大多數(shù)運動神經(jīng)元都長出突起，有的胚胎很少有運動神經(jīng)元長出突起。運動神經(jīng)元突起發(fā)育情況見圖1，與正常的運動神經(jīng)元相比，部分神經(jīng)元發(fā)育呈重度和中度缺失。對各組胚胎的運動神經(jīng)元發(fā)育狀況進行分析歸納，結(jié)果表明，5μg/ml丙泊酚處理導(dǎo)致斑馬魚胚胎運動神經(jīng)元發(fā)育畸形（重度缺失和中度缺失）的比例明顯增加（P＜0.01，表1），說明丙泊酚能夠影響運動神經(jīng)元發(fā)育。

圖1 激光共聚焦顯微鏡運動神經(jīng)元缺失程度圖（a：方框所示為本實驗工具所拍攝運動神經(jīng)元節(jié)段；b：運動神經(jīng)元發(fā)育重度缺失，×20；c：運動神經(jīng)元發(fā)育中度缺失，×20；d：正常的運動神經(jīng)元，×20）

表1 各組斑馬魚胚胎運動神經(jīng)元缺失程度比較[個（%）]

3 討論

臨床回顧性研究發(fā)現(xiàn)，嬰幼兒早期接受全身麻醉和鎮(zhèn)靜，可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，包括學(xué)習(xí)能力下降、認知功能減低等。丙泊酚是目前最常用的全身靜脈麻醉藥，具有起效快、蘇醒迅速及蘇醒平穩(wěn)等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于嬰幼兒全麻誘導(dǎo)和維持[7]。由于哺乳動物胚胎在子宮內(nèi)發(fā)育，丙泊酚對活體胚胎期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受到限制。斑馬魚因其胚胎體外受精及發(fā)育，通體透明、易于觀察等特點，突破上述限制，已廣泛應(yīng)用于神經(jīng)發(fā)育研究，成為研究胚胎期藥物神經(jīng)毒性的首選模式動物。

近來眾多研究明確證實，丙泊酚可改變樹突棘形態(tài)和突觸結(jié)構(gòu)來影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，從而導(dǎo)致運動、學(xué)習(xí)等功能障礙[8-9]，而對運動神經(jīng)元生長發(fā)育的影響尚未見報道。研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚的神經(jīng)毒性在嚙齒類動物出生后7～14d最為敏感。而在神經(jīng)干細胞的分化、遷移及增殖期間，丙泊酚是否能通過影響軸突的生長來影響神經(jīng)元的發(fā)育尚未見報道，探討這一問題具有重要意義。本研究表明，丙泊酚處理影響斑馬魚胚胎運動神經(jīng)元發(fā)育，表現(xiàn)為運動神經(jīng)元未分化細胞增多，軸突不能投射到相應(yīng)的肌肉。在本研究中，斑馬魚胚胎暴露于5μg/ml的丙泊酚中，胚胎整體發(fā)育與DMSO組及空白對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異；5μg/ml丙泊酚處理導(dǎo)致斑馬魚胚胎運動神經(jīng)元發(fā)育畸形的比例明顯增加（P＜0.01）。因此，5μg/ml丙泊酚暴露對斑馬魚胚胎的整體發(fā)育影響與對照組相比無統(tǒng)計學(xué)差異，由于正常狀況下也有少部分胚胎出現(xiàn)重度缺失和中度缺失的情況，因此筆者推測丙泊酚的作用可能是延遲運動神經(jīng)元突起的生長。

綜上所述，斑馬魚胚胎早期暴露于丙泊酚會引起運動神經(jīng)元發(fā)育的缺陷。這表明丙泊酚作為常用的嬰幼兒臨床手術(shù)麻醉藥是存在影響嬰幼兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育風(fēng)險的。但運動神經(jīng)元的發(fā)育是一個復(fù)雜且精密的過程，丙泊酚影響運動神經(jīng)元發(fā)育的機制還有待深入的探索。