辛伐他汀對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠的治療機(jī)制探索*

王友蓮 楊明峰 尚 可 皮 慧

辛伐他汀對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠的治療機(jī)制探索*

王友蓮1楊明峰2尚 可1皮 慧2

目的 以膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠為模型，觀察辛伐他汀對其血清細(xì)胞因子及滑膜組織天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）表達(dá)的影響，探索辛伐他汀治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的可能機(jī)制。方法使用牛Ⅱ型膠原建立CIA模型，將造模成功的大鼠（16只）均分為模型組及藥物組，未造模者（7只）為對照組。藥物組用2.0 mg/（kg·d）灌胃，對照組和模型組用無菌注射用水5 mL/（kg·d）灌胃。記錄大鼠關(guān)節(jié)炎評分（AI）和足趾容積，每周1次；初次免疫后第42天，眼內(nèi)眥取血采用ELISA法檢測各組血清腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細(xì)胞介素（IL）-6水平，處死大鼠取后肢踝關(guān)節(jié)進(jìn)行HE染色，并用免疫組織化學(xué)檢測滑膜組織Caspase-3表達(dá)。結(jié)果藥物組和模型組AI在初次免疫后21 d開始下降，35 d后藥物組均低于模型組（均P＜0.05）。2組足趾容積于初次免疫14 d后緩慢下降，但仍明顯高于對照組；35、42 d時(shí)藥物組均低于模型組（均P＜0.05）。初次免疫后42 d，藥物組TNF-α和IL-6水平均低于模型組，高于對照組（均P＜0.05）。藥物組較模型組踝關(guān)節(jié)滑膜組織增生明顯減輕，僅有少量炎細(xì)胞浸潤，Caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)。結(jié)論辛伐他汀可明顯抑制CIA大鼠血清TNF-α、IL-6的分泌，上調(diào)滑膜組織Caspase-3的表達(dá)及減輕滑膜組織增生。

辛伐他汀；關(guān)節(jié)炎,類風(fēng)濕；白細(xì)胞介素6；腫瘤壞死因子α；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性炎癥疾病，主要表現(xiàn)為慢性、對稱性、破壞性多關(guān)節(jié)炎及系統(tǒng)損傷。辛伐他汀是一種HMGCoA還原酶抑制劑，具有較強(qiáng)的降血脂作用。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀同時(shí)具有抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用，且這些作用與其傳統(tǒng)的降脂作用無關(guān)[1]。本研究以膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠為模型，觀察辛伐他汀對CIA的治療效果，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠30只，SPF級，雌性，體質(zhì)量140～160 g，購自長沙市開福區(qū)東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技服務(wù)部[許可證號：SCXKS（湘）2009-0012]，于實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)住宿條件：光照、黑暗各12 h，濕度55%～60%，室溫（22±2）℃。

1.2 主要儀器和試劑 白細(xì)胞介素（IL）-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（美國raybiotech公司）。牛Ⅱ型膠原（C7806）、弗氏完全佐劑（卡介苗含量1 g/L，美國sigma公司）。兔抗鼠含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-3（anbo公司）。二步法免疫組化試劑盒及DAB顯色液（中杉金橋公司）。

1.3 動(dòng)物免疫 牛Ⅱ型膠原20 mg溶于10 mL 0.1 mol/L的醋酸溶液中，4℃過夜備用。取等劑量膠原溶液及弗氏完全佐劑，在冰上，用玻璃注射器中間連接三通閥，互推1 h，可完全乳化，乳劑中膠原濃度為1 g/L。隨機(jī)取23只大鼠，每只大鼠尾根部及背部3點(diǎn)皮內(nèi)注射共0.35 mL乳化液，10 d后采用相同方法免疫，劑量為0.2 mL。另外7只大鼠采用相同方法注射生理鹽水。

1.4 分組及給藥 于初次免疫后第14天采用5級評分法對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）進(jìn)行評分，每周1次，評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，無紅腫；1分，小趾關(guān)節(jié)輕度紅腫；2分，小趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪、關(guān)節(jié)腫脹，共16分。將得分≥6分的16只大鼠均分為模型組及藥物組，7只未進(jìn)行造模者為對照組，并將造模失敗者（7只）處死。藥物組給予辛伐他汀按2.0 mg/(kg·d)灌胃，對照組及模型組給予無菌注射用水5 mL/(kg·d)灌胃。藥物組、模型組均有1只大鼠分別在給藥第16、21天時(shí)出現(xiàn)意外死亡。

1.5 足趾容積測定 使用自制足趾容積測量器，每周測量1次踝關(guān)節(jié)以下全足容積，每只大鼠測量3次取平均值。

1.6 TNF-α和IL-6測定 初次免疫后42 d，眼內(nèi)眥靜脈取得血標(biāo)本，于室溫下放置1 h，離心（1 800 r/min，10 min），分離血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書步驟檢測各組大鼠血清TNF-α和IL-6水平。

1.7 踝關(guān)節(jié)HE染色及Caspase-3檢測 初次免疫后42 d處死大鼠，取各大鼠后肢踝關(guān)節(jié)迅速置于10%中性甲醛中固定7 d，置于10%乙二胺四乙酸（EDTA）脫鈣液中35 d，用針灸針檢測脫鈣完全后，流水沖洗2 h，縱向切開，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm切片后行HE染色或微波修復(fù)，嚴(yán)格按照說明書步驟檢測踝關(guān)節(jié)滑膜組織Caspase-3的表達(dá)，一抗采取1∶80稀釋及4℃過夜孵育，DAB顯色后蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組間比較方差齊者采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)；方差不齊者采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物組和模型組大鼠一般情況及體質(zhì)量變化 藥物組大鼠于造模后11 d開始出現(xiàn)一側(cè)或雙側(cè)后肢輕度紅腫，食欲不振，活動(dòng)減少。14 d雙側(cè)后肢嚴(yán)重紅腫且不能負(fù)重。自起始時(shí)至初次免疫后14 d各組大鼠體質(zhì)量基本相同（P＞0.05），14 d后模型組和藥物組體質(zhì)量增長緩慢，35 d后藥物組體質(zhì)量明顯高于模型組（35、42 d時(shí)F值分別為4.083、7.918，均P＜0.05），見圖1。

Figure 1 Changes of body weights in different time groups of rats圖1 不同時(shí)間各組大鼠體質(zhì)量的變化

2.2 辛伐他汀對CIA大鼠AI的影響 藥物組和模型組大鼠AI在初次免疫后21 d開始下降，35 d后藥物組AI均低于模型組（35、42 d時(shí)t值分別為2.717、3.536，均P＜0.05），見圖2。

Figure 2 Changes of arthritis index in different time groups of rats圖2 不同時(shí)間藥物組和模型組大鼠AI的變化

2.3 辛伐他汀對CIA大鼠足趾容積的影響 藥物組和模型組大鼠足趾容積在初次免疫后7 d開始顯著增加，14 d后開始緩慢下降；14 d后2組大鼠足趾容積均明顯高于對照組（14、21、28、35及42 d時(shí)，F(xiàn)值分別為120.438、147.209、195.741、218.846及113.850，均P＜0.05）。初次免疫后35、42 d，藥物組大鼠足趾容積均明顯低于模型組（均P＜0.05），見圖3。

Figure 3 Changes of hind paw volume in different time groups of rats圖3 不同時(shí)間各組大鼠足趾容積的變化

2.4 辛伐他汀對CIA大鼠TNF-α和IL-6的影響 初次免疫后42 d，藥物組TNF-α和IL-6水平均低于模型組，高于對照組（均P＜0.05），見圖4。

Figure 4 Comparison of serum levels of TNF-α and IL-6 at 42 days after the initial immunization between different groups of rats圖4 初次免疫后42 d時(shí)各組大鼠血清TNF-α、IL-6的比較

2.5 辛伐他汀對CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病理的影響 對照組大鼠踝關(guān)節(jié)腔滑膜組織結(jié)構(gòu)清楚，無增生，滑膜內(nèi)無炎細(xì)胞浸潤；藥物組大鼠關(guān)節(jié)腔滑膜組織稍有增生，且僅有少量炎細(xì)胞浸潤；模型組大鼠關(guān)節(jié)腔滑膜組織明顯增生，大量炎細(xì)胞浸潤，見圖5。

2.6 辛伐他汀對CIA大鼠踝關(guān)節(jié)Caspase-3表達(dá)的影響 對照組和模型組大鼠關(guān)節(jié)腔滑膜組織僅有極少量表達(dá)Caspase-3的陽性細(xì)胞，藥物組大鼠關(guān)節(jié)腔滑膜組織Caspase-3的表達(dá)明顯增多，見圖6。

3 討論

近年來有研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可通過抑制MHCⅡ的反式激活因子進(jìn)而抑制干擾素（IFN）-γ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞MHCⅡ的表達(dá)，通過抑制Rho通路激活過氧化物酶體增生物激活受體-α。此外，其可通過識別β2整合素上的相應(yīng)位點(diǎn)，進(jìn)而使淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（LFA-1）與細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）之間相互作用，誘導(dǎo)T細(xì)胞的聚集，這些屬性表明他汀類藥物可能可以調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的成熟，進(jìn)而發(fā)揮其抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[1]。國內(nèi)外研究已證明他汀類藥物在各種炎癥動(dòng)物模型及炎性疾病方面具有良好的抗炎作用[2-3]，但其確切的抗炎機(jī)制尚未完全闡明。

RA的病理特點(diǎn)主要表現(xiàn)為滑膜組織中大量的炎性細(xì)胞浸潤及由此導(dǎo)致的滑膜增生、血管翳形成及骨質(zhì)破壞。本研究結(jié)果顯示CIA大鼠TNF-α、IL-6水平明顯升高，提示TNF-α、IL-6在大鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中具有重要的作用，而在辛伐他汀治療后TNF-α、IL-6、AI評分及足趾容積均明顯降低，同時(shí)踝關(guān)節(jié)的HE染色也顯示辛伐他汀治療后CIA大鼠滑膜組織增生及炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕，提示辛伐他汀可通過抑制CIA大鼠TNF-α、IL-6的分泌進(jìn)而發(fā)揮其抗炎作用，使CIA大鼠的AI評分及足趾容積明顯下降并使踝關(guān)節(jié)滑膜組織病變明顯減輕。這與以往在他汀類藥物（辛伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀）治療關(guān)節(jié)炎方面的研究結(jié)果一致，這些研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可通過抑制滑膜細(xì)胞RhoA信號通路活性及抑制Th1相關(guān)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)進(jìn)而發(fā)揮其抗炎作用[4-6]。此外，本研究通過免疫組化進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了辛伐他汀治療后滑膜組織凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)明顯上調(diào)，提示辛伐他汀治療后CIA大鼠滑膜組織增生明顯減輕可能與炎癥細(xì)胞浸潤改善后，凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)上調(diào)促使滑膜細(xì)胞凋亡增加有關(guān)，與以往的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致[7-8]。

綜上所述，辛伐他汀可有效降低CIA大鼠血清TNF-α、IL-6的水平，上調(diào)滑膜組織Caspase-3的表達(dá)及抑制滑膜組織增生，從而發(fā)揮其治療作用。辛伐他汀將可能會(huì)成為一種新的RA治療藥物，為臨床治療RA提供更多的選擇。

Figure 5 Comparison of the pathological changes of ankle joint between different groups of rats(HE,×400)圖5 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理比較（HE,×400）

Figure 6 Comparison of the Caspase-3 expression in ankle joint between different groups of rats(PV,×400)圖6 各組大鼠踝關(guān)節(jié)Caspase-3表達(dá)的比較（PV,×400）

[1] Ma S,Ma CC.Recent development in pleiotropic effects of statins on cardiovascular disease through regulation of transforming growth factorbeta superfamily[J].Cytokine Growth Factor Rev,2011,22(3):167-175.

[2]王濤,浦奎,孔德領(lǐng),等.辛伐他汀對大鼠心肌梗死后TNF-α、IL-6表達(dá)及心室重構(gòu)的干預(yù)研究[J].天津醫(yī)藥,2009,37(7):585-588.

[3] Jaiswal SR,Sontakke SD.Experimental evaluation of analgesic and anti-inflammatory activity of simvastatin and atorvastatin[J].Indian J Pharmacol,2012,44(4):475-479.

[4] 趙征.洛伐他汀及巴曲酶治療膠原誘導(dǎo)性大鼠關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究[D].北京：中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院，2009.

[5] Palmer G,Chobaz V,Talabot-Ayer D,et al.Assessment of the efficacy of different statins in murine collagen induced arthritis[J].Arthritis Rheum,2004,50(12):4051-4059.

[6]陳偉玲，梁柳琴，邱茜，等.辛伐他汀對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞分泌趨化因子的影響及其機(jī)制[J].中國病理生理雜志, 2011,27(10):1972-1976.

[7]Yokota K,Miyoshi F,Miyazaki T，et al.High concentration simvastatin induces apoptosis in fibroblast-like synoviocytes from patients with rheumatoid arthritis[J].J Rheumatol,2008 35(2):193-200.

[8] Litinsky I,Golan I,Yaron M,et al.Simvastatin induces apoptosis of fibroblast-like synoviocytes[J].Open Rheumatol J,2009,3:35-40.

（2013-06-30收稿 2013-08-28修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Therapeutic Mechanism of Simvastatin on Collagen Induced Arthritis in Rats

WANG Youlian1,YANG Mingfeng2,SHANG Ke1,PI Hui2
1 Department of Rheumatology and Immunology,the People’s Hospital in Jiangxi Province,Nanchang 330006,China; 2 Medical College of Nanchang University

Objective To evaluate therapeutic effects of simvastatin on serum expressions of cytokines and synovial tissue aspartic protease-3(Caspase-3)in collagen induced arthritis(CIA)in rats,and the mechanism thereof.MethodsThe rat model of CIA was established by injecting bovineⅡ collagen.Sixteen model rats were randomly divided into two groups:CIA model group(sterile water 5 mL·kg-1·d-1by gavage)and simvastatin group(2.0 mg·kg-1·d-1by gavage).Seven normal rats were included in control group(sterile water 5 mL·kg-1·d-1by gavage).The arthritis index(AI)and hind paw volumes were recorded once a week.The serum levels of cytokine,tumor necrosis factor(TNF)-α and interleukin(IL)-6 were measured by ELISA 42 days after the initial immunization.The expression of Caspase-3 in ankle synovial tissue was detected by immunohistochemical method,and pathological results of HE staining in rat ankle were compared between three groups.ResultsValues of AI were decreased on the 24-d of the initial immunization in simvastatin group and CIA model group,which was significantly decreased on the 35-d of the initial immunization in simvastatin group than that of CIA model group(P＜0.05).The values of hind paw volumes were decreased on the 14-d of the initial immunization in simvastatin group and CIA model group,which was still significantly higher than those of control group(P＜0.05).The values of hind paw volumes were decreased on the 35-d and 42-d of the initial immunization in simvastatin group than those of CIA model group(P＜0.05).The serum levels of TNF-α and IL-6 on the 42-d of the initial immunization were significantly lower in simvastatin group than those of CIA model group,but which were significantly higher than those of control group(P＜0.05). There were more synovial hyperplasia in simvastatin group than those of CIA model group.Only a small amount of inflammatory cell infiltration was found in simvastatin group.The expression of Caspase-3 was significantly higher in simvastatin group than that of CIA model group.ConclusionSimvastatin can significantly inhibit the serum levels of TNF-α and IL-6 in CIA model rats,and can up-regulate the expression of Caspase-3 in ankle of model rats.

simvastatin;arthritis,rheumatoid;interleukin-6;tumor necrosis factor-alpha;caspase 3

R593

A【DOI】10.3969/j.issn.0253-9896.2014.01.018

*江西省科技廳支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號：20112BBG70040）

1江西省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科（郵編330006）；2南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院