熱敏灸對腦缺血再灌注損傷大鼠SOD、MDA的影響*

肖愛嬌 陳日新 康明非 張 毫

熱敏灸對腦缺血再灌注損傷大鼠SOD、MDA的影響*

肖愛嬌1陳日新2康明非2張 毫3

目的 觀察熱敏灸對局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠超氧化物歧化酶（SOD）的活性、表達和丙二醛（MDA）含量的影響，以闡明熱敏灸減輕腦缺血再灌注損傷的作用機制。方法雄性SD大鼠36只，分為假手術組、模型組、艾灸組和熱敏灸組。采用線栓法閉塞大腦中動脈2 h后進行再灌注，制備局灶性腦缺血再灌注損傷模型；比色法測定SOD活性和MDA含量；Western blot技術檢測大鼠大腦皮質SOD2蛋白的表達。結果熱敏灸組大鼠血清和大腦皮質SOD活性（22.78±1.31）U/mL、（4 909.6±1 345.6）U/g均高于模型組（20.17±1.12）U/mL、（2 602.0±1 515.5）U/g，血清和大腦皮質MDA含量（3.78±2.00）μmol/L、（1 226.5±38.4）nmol/g均低于模型組（16.82±6.70）μmol/L、（1 905.6± 478.6）nmol/g；大腦皮質SOD2蛋白表達量（0.974±0.166）高于模型組的（0.702±0.040）。結論熱敏灸具有減輕大鼠腦缺血再灌注損傷的作用，提高SOD活性和表達、降低氧自由基含量可能是其作用機制之一。

腦缺血；再灌注損傷；超氧化物歧化酶；丙二醛；穴位貼敷法；大鼠，Sprague-Dawley；熱敏灸

腦血管疾病是危害人類生命和健康的主要疾病之一，缺血性腦血管病約占全部腦血管病的80%左右[1]。腦缺血后再灌注損傷是大多數缺血性腦血管病的主要病理生理過程。研究發現，腦組織缺血2 h后進行再灌注可造成腦缺血再灌注損傷[2]。目前認為自由基的作用是腦缺血再灌注損傷的重要發病環節，因為生成的自由基可與各種細胞成分，如膜磷脂、蛋白質、核酸等發生氧化反應，造成細胞結構損傷和功能代謝障礙[3-4]。臨床實踐表明，熱敏灸治療急性缺血性中風具有較好的效果[5]；而且動物研究也觀察到，熱敏炙“大椎”穴能顯著縮小大腦中動脈缺血再灌注損傷模型大鼠的腦梗死面積，即減輕腦缺血再灌注損傷[6-7]。然而熱敏灸是否通過增加抗氧化酶表達、提高抗氧化酶活性和降低自由基作用，達到減輕腦缺血再灌注損傷的作用機制還不十分清楚。本研究探討熱敏灸減輕腦缺血再灌注損傷的作用機制，旨在為熱敏灸在臨床缺血性中風防治中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 清潔級SD大鼠36只，雄性，體質量220～280 g，由江西中醫藥大學實驗動物中心提供（合格證編號：JZDW2011-0336）。采用隨機數字表法將大鼠分為假手術組（6只）、模型組（10只）、艾灸組（10只）和熱敏灸組（10只）。納入標準：再灌注時神經功能缺失評分為1～3分且存活≥3 d者。本實驗除模型組死亡1只、艾灸組死亡3只、熱敏灸組死亡2只大鼠外，其余大鼠均完成實驗。

1.1.2 主要試劑 超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒和丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。一抗：兔抗大鼠β-actin（45 ku,Cell Signaling），兔抗大鼠SOD2（25 ku,Santa Cruz Biotechnology）。二抗：辣根酶標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）。蛋白質分子質量標準（14～100 ku，北京全式金生物技術有限公司），化學發光底物（Pierce Biotechnology）。

1.1.3 主要實驗儀器 Leica2000顯微鏡及圖像分析軟件（德國Leica公司），Scientz-ⅡD型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司），RT-6000酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司），PowerPac Universal電泳儀電源、Mini-PROTEAN tetraCell垂直電泳槽、TRANS-BLOT SD轉移電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 局灶性腦缺血再灌注損傷模型制備 模型組、艾灸組和熱敏灸組大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型參照Longa等[8]的頸內動脈線栓法并略作改良，假手術組同模型組，但不插栓線，術后均單籠飼養。具體操作方法參照文獻[2]。

1.2.2 艾灸取穴與方法 在腦缺血再灌注后次日，將艾灸組和熱敏灸組大鼠項部的毛發剪去，露出“大椎”穴[9]，作為艾灸穴位。艾灸方法：用直徑0.4 cm，長10 cm的艾條（江西中醫藥大學附屬醫院制），距穴位2 cm左右溫和灸大鼠，每日1次，艾灸組15 min/次，熱敏灸組35 min/次，共3 d。

1.2.3 血清、大腦皮質SOD活性和MDA含量測定 于腦缺血再灌注后3 d，大鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，抽取腹主動脈血5 mL置于離心管，2 500 r/min離心15 min，收集血清。在冰上迅速分離出大腦皮質，稱取腦組織質量加9倍生理鹽水，制成10%勻漿液，2 000 r/min離心10 min，收集上清液。SOD活性采用WST-1法，MDA含量采用硫代巴比妥酸（TAB）法進行測定。同時測定組織蛋白濃度。

1.2.4 大腦皮質SOD2蛋白表達檢測 采用Western blot技術進行檢測。按照1.2.3中的方法剝離出左側大腦皮質，參照文獻[10]檢測SOD2蛋白表達水平。不同的是，轉膜條件為15 V轉膜35 min；封閉條件是將PVDF膜置于5%脫脂牛奶封閉液中室溫下封閉2 h；一抗及濃度為兔抗大鼠SOD2抗體（1∶1 500）。

1.3 統計學方法 用SPSS 10.0統計軟件進行分析。數據以±s表示。用方差分析進行檢驗，組間多重比較采用LSD-t法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清和大腦皮質中SOD活性和MDA含量的比較 與模型組相比，假手術組血清SOD活性增高，血清和大腦皮質MDA含量減低；艾灸組和熱敏灸組血清和大腦皮質SOD活性增高，而MDA含量減少（P＜0.05），見表1。

Table 1 The serum and cortex levels of superoxide dismutase and malondialdehyde and relative expression of SOD2 protein in three groups of rats表1 各組血清和大腦皮質中SOD活性、MDA含量和SOD2蛋白相對表達量 ）

Table 1 The serum and cortex levels of superoxide dismutase and malondialdehyde and relative expression of SOD2 protein in three groups of rats表1 各組血清和大腦皮質中SOD活性、MDA含量和SOD2蛋白相對表達量 ）

＊P＜0.05，a與模型組比較P＜0.05

組別假手術組模型組艾灸組熱敏灸組F n 6978血清SOD（U/mL）22.19±0.92a20.17±1.12 22.42±2.16a22.78±1.31a3.187＊MDA（μmol/L）2.25±1.33a16.82±6.70 2.57±1.40a3.78±2.00a19.185＊組別假手術組模型組艾灸組熱敏灸組F n 6978大腦皮質SOD（U/g）3 185.5±392.1 2 602.0±1 515.5 5 032.4±1 042.0a4 909.6±1 345.6a5.949＊MDA（nmol/g）823.3±67.9a1 905.6±478.6 1 328.2±349.1a1 226.5±38.4a9.349＊SOD2蛋白相對表達量1.093±0.153a0.702±0.040 0.849±0.124 0.974±0.166a6.083＊

2.2 各組大鼠大腦皮質SOD2蛋白表達的比較 βactin、SOD2蛋白分別于45 ku和25 ku處出現清晰的條帶。與模型組相比，假手術組熱敏灸組SOD2蛋白的相對表達量增加（P＜0.05），見表1、圖1。

Figure 1 The expression of SOD2 protein in rat cortex after 3-d ischemia-reperfusion injury detected by Western blot assay圖1 Western blot檢測大鼠腦缺血再灌注后3 d大腦皮質SOD2蛋白表達結果

3 討論

艾灸療法是借助艾草燃燒時發出的藥力和紅外線溫熱刺激，來熏灼特定的穴位，刺激組織以調和氣血、疏通經絡，從整體上調節臟腑功能，以達到治病防病、養生保健的目的。該療法操作簡便，未見任何不良反應，日益受到患者的親睞，且熱敏灸療法的出現明顯提高了灸療療效[11]。大量臨床實踐表明，熱敏灸治療多種疾病都有很好效果，其治療急性缺血性中風也取得了較好的療效[5]，而且在前期的動物實驗中，本課題組研究觀察到，熱敏灸“大椎”穴能顯著縮小腦缺血再灌注損傷模型大鼠的腦梗死面積，減輕腦缺血再灌注損傷[6-7]。本文在此基礎上進一步探討熱敏灸減輕腦缺血再灌注損傷的作用機制。

許多研究表明，氧自由基生成增多是缺血再灌注損傷發生的主要機制之一[3-4]。機體內氧自由基主要是活性氧（ROS）反應產物，包括超氧陰離子、羥自由基等。ROS可以是細胞正常代謝的產物，參與了生命過程中的許多化學反應，如氧化還原反應、光合作用等，在機體的生命活動中扮演著重要的角色。但由于自由基的高度化學活潑性，它極易與相鄰的物質發生電子的得、失交換，而且病理情況下自由基生成的數量大大增加，超出了機體的調控、保護能力，繼而攻擊核酸、蛋白質、脂質等生物大分子，造成組織細胞的損傷。MDA是脂質過氧化反應的代謝產物，其含量的高低間接反映了組織中氧自由基含量的變化，以及細胞受自由基攻擊后脂質過氧化的程度[3]。有研究觀察到，腦缺血再灌注時，MDA含量明顯增加[12-14]。本研究結果表明，熱敏灸可能通過降低MDA含量達到減輕腦缺血再灌注損傷。

SOD是體內十分重要的抗氧化酶，分布于全身各組織中，根據其分布位置不同將SOD分為3種：SOD-1（Cu-Zn SOD），主要分布在胞漿和血漿中；SOD-2（Mn-SOD）主要分布在線粒體中；胞外SOD（EC-SOD）主要分布在細胞外間隙中，它們的功能都是與超氧陰離子反應形成過氧化氫，再由過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶轉變成水，從而使自由基清除，保護細胞免受損害。由于超氧陰離子常是活性氧生成過程中的初始產物，因此，SOD也被看作為活性氧防御的第一線，其活性的高低反映了機體抗氧化能力的強弱。局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠體內SOD活性顯著降低，提高SOD活性可減輕腦缺血再灌注損傷[13-14]。本研究結果提示，熱敏灸可能通過提高SOD活性和表達減輕腦缺血再灌注損傷，與上述研究結果基本一致。

綜上所述，大腦中動脈缺血2 h后進行再灌注引起的氧自由基生成過多、抗氧化酶活性降低和表達減少可能是造成腦缺血再灌注損傷發生機制之一，而提高機體內抗氧化酶活性、增加其表達以及降低MDA含量則可能是熱敏灸“大椎”穴減輕腦缺血再灌注損傷、發揮腦保護效果的作用機制之一。

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（2013-07-15收稿 2013-09-02修回）

（本文編輯 魏杰）

Effects of Heat-Sensitive Moxibustion on Antioxidative Capacity in Rat Model of Focal Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury

XIAO Aijiao1,CHEN Rixin2,KANG Mingfei2,ZHANG Hao3
1 Basical Medical School of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,China;2 Department of Acupuncture and Moxibustion,the Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine;3 Graduate College of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine

ObjectiveTo observe the effects of heat-sensitive moxibustion on the expression and activity of superoxide dismutase(SOD)and the content of malondialdehyde(MDA)in focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats,and the mechanism thereof.MethodsThirty-six male SD rats were randomly divided into four groups,sham-operated group (n=6),ischemia-reperfusion(I/R)injury group(n=10),I/R injury with 15-minute moxibustion group(n=10)and I/R injury with 35-minute moxibustion group(n=10).The focal cerebral ischemia-reperfusion rat model was induced by middle cerebral artery occlusion(MCAO)for 2 h followed by reperfusion.Values of SOD activity and MDA content were determined by colorimetry,and the cortical expression of SOD2 protein was detected by Western blot technique.ResultsValues of SOD activities were significantly higher in serum(22.78±1.31)U/mL and cortex(4 909.6±1 345.6)U/g of heat-sensitive moxibustion group than those of model group(20.17±1.12)U/mL and(2 602.0±1 515.5)U/g.Values of MDA contents were significantly decreased in serum(3.78±2.00)μmol/L and cortex(1 226.5±38.4)nmol/g in heat-sensitive moxibustion group than those of model group(16.82±6.70)μmol/L and(1 905.6±478.6)nmol/g.The cortical expression of SOD2 protein(0.974±0.166) was higher in heat-sensitive moxibustion group than that of model group(0.702±0.040).ConclusionHeat-sensitive moxibustion could reduce the damage of cerebral inchemia-reperfusion,which might be through improving SOD activity,increasing SOD expression and decreasing MDA content.

brain ischemia;reperfusion injury;superoxide dismutase;malondialdehyde;acupoint sticking therapy; rats,Sprague-Dawley;heat-sensitive moxibustion

R743

A【DOI】10.3969/j.issn.0253-9896.2014.01.016

*國家自然科學基金資助項目（項目編號：81060305）；江西省衛生廳中醫藥科研計劃課題（項目編號：2012A004）；江西省教育廳科技項目（項目編號：GJJ13614）

1江西中醫藥大學基礎醫學院生理學學科組（郵編330004）；2江西中醫藥大學附屬醫院針灸康復科；3江西中醫藥大學研究生院