人乳腺癌特異性基因1 m RNA實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測試劑盒的建立及應(yīng)用

程民，沈國棟，卞庚，徐婷娟，徐維平，沈干，3，胡世蓮

（1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，合肥 230001；2.安徽省老年醫(yī)學研究所；3.腫瘤免疫與營養(yǎng)治療安徽省重點實驗室）

·基礎(chǔ)研究·

人乳腺癌特異性基因1 m RNA實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測試劑盒的建立及應(yīng)用

程民1，2，3，沈國棟1，2，3，卞庚2，徐婷娟1，3，徐維平1，沈干2，3，胡世蓮1，2，3

（1.安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，合肥 230001；2.安徽省老年醫(yī)學研究所；3.腫瘤免疫與營養(yǎng)治療安徽省重點實驗室）

目的建立人乳腺癌特異性基因1（BCSG1）mRNA實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）檢測試劑盒，并評價其在乳腺癌循環(huán)腫瘤細胞檢測中的應(yīng)用價值。方法優(yōu)化試劑盒中各組分的濃度、確定試劑盒的穩(wěn)定性、靈敏度及特異性，并檢測外周血樣品中BCSG1 mRNA的表達水平。結(jié)果優(yōu)化了試劑盒中的引物、探針，成功制備了定值標準品，通過設(shè)立陰、陽性質(zhì)控品的方法，解決了試劑盒的特異性、靈敏性、準確性及質(zhì)量控制等關(guān)鍵技術(shù)問題，特異度及準確性均為95%以上，靈敏度為100拷貝／ml（全血）。外周血標本中BCSG1 mRNA的檢測結(jié)果為，12例臨床確診已轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者均為陽性，21例臨床未確診轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中12例為陽性，其余9例為陰性，15例乳腺良性疾病患者、10例正常人均為陰性。結(jié)論建立的BCSG1 mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒具有很高的臨床應(yīng)用價值，可用于檢測外周血樣品中BCSG1 mRNA的表達量，檢測結(jié)果可作為乳腺癌患者診療過程中的重要監(jiān)測指標。

乳腺腫瘤；試劑盒，診斷；RNA，信使；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

乳腺癌作為一種常見的惡性腫瘤，嚴重威脅女性的生命和健康。近年來我國乳腺癌的發(fā)病率明顯增高，2012年，我國乳腺癌發(fā)病率為42.55／10萬，居女性惡性腫瘤的第一位。目前，乳腺癌手術(shù)切除是其主要治療措施，但術(shù)后復發(fā)和轉(zhuǎn)移已成為阻礙患者生存期提高的主要原因。外周血中循環(huán)腫瘤細胞的檢測，特別是腫瘤基因標志物mRNA的定量測定，有利于乳腺癌轉(zhuǎn)移和復發(fā)的早期診斷，治療方案的確定以及預后的判斷。乳腺癌特異性基因1 （BCSG1）是一種特異性的在乳腺癌中選擇性表達的基因，其在乳腺癌組織中存在特異性表達，在正常乳腺或良性乳腺病變中幾乎不表達，是一種與乳腺癌進展有關(guān)的腫瘤基因標記物。因此，建立乳腺癌患者外周血中BCSG1 mRNA檢測試劑盒，并將其應(yīng)用于臨床診斷，對判斷乳腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復發(fā)，治療效果評價及病情的動態(tài)觀察等具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 外周血標本 在本研究中，我們由安徽省立醫(yī)院、安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院及合肥市第一人民醫(yī)院共收集乳腺癌患者外周血標本33份，其中12份為臨床上已確診遠端轉(zhuǎn)移的標本；乳腺增生及乳腺炎患者外周血標本15份；正常人外周血標本10份。

1.1.2 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）試劑 Trizol試劑購于Invitrogen公司，異丙醇、氯仿、無水乙醇等分析純試劑購自國藥集團化學試劑有限公司，焦碳酸二乙酸鈉（DEPC）購自BIOBASIC（BBI）公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTPmix （10mM）、OligdT18、Taq DNA聚合酶購自大連寶生物工程有限公司，熒光定量PCR試劑購自Invitrogen公司，BCSG1上游引物：5’-GGGTGA GGC ATC CAA AGA GA-3’；下游引物：5’-TGGGCA GCC GCA TGT C-3’；探針：5’-FAM-AGA GGA AGT GGC AGA GGA GGC CCA-TAMRA-3’；β-actin上游引物：5’-TTGCCGACA GGA TGC AGA A-3’；下游引物：5’-GCC GAT CCA CAC GGA GTA CTT-3’；探針：5’-FAM-TCA TTGCTC CTC CTGAGC-TAMRA-3’；上述引物和探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.3 核酸電泳檢測試劑 瓊脂糖購自Spanish公司，Tris試劑購自Amresco公司，乙酸、硼酸、EDTA購自國藥集團化學試劑有限公司，溴化乙錠（EB）購自Amresco公司，6×上樣緩沖液購自大連寶生物工程有限公司，100bp DNA ladder購自Fermentas公司。

1.1.4 細胞株、培養(yǎng)基 K562細胞（rythroleukemia cell line）和SK-BR-3細胞（breast ademocarcinoma cell line）購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），RPMI 1640、DMEM干粉培養(yǎng)基購自Gibco公司，碳酸氫鈉（分析純）、二甲基亞砜（分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司，胎牛血清購自上海依科賽生物制品有限公司，胰蛋白酶購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.5 菌株、載體及質(zhì)粒制備試劑 大腸桿菌DH5α（感受態(tài)）由本室保存；T-載體（pMD18-T Vector）購自大連寶生物工程有限公司，PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自Promega公司，質(zhì)粒（小量）提取試劑盒購自Axygen公司，質(zhì)粒（大量）提取試劑盒購自安徽優(yōu)晶生物工程有限公司，胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉購自英國OXOID公司，NaCl（分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司，購自氨芐青霉素購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 外周血有核細胞分離 采靜脈血3 mL于5 mL EDTA抗凝管中，使用紅細胞裂解液（0.01 mol／L Tris-HCl pH7.6，0.01mol／L NaCl，0.005 mol／L MgCl2）裂解紅細胞，4℃，450 g，離心10 min，收集有核細胞，備用。

1.2.2 總RNA提取 外周血有核細胞、K562細胞（陰性對照）和SK-BR-3細胞（陽性對照）的總RNA均按Trizol試劑盒方法提取。

1.2.3 實時熒光定量RT-PCR （1）RT反應(yīng)：總體積為10 μL，包括反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液3.5 μL、總RNA溶液5.0 μL、無RNA酶的水1.5 μL。反應(yīng)條件為：37℃，20 min；95℃，5 min。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物取出置于冰盒上，備用。（2）標準品的處理：將標準品儲存液（2×107拷貝數(shù)／μL）梯度稀釋為2×106，2×105，2×104，2×103，2×102，2×101拷貝數(shù)／μL，備用。（3）熒光定量PCR反應(yīng)：在ABI公司7000型定量PCR儀上進行PCR擴增；反應(yīng)體系為：模板5.0 μL、PCR反應(yīng)液15.0 μL、水5.0 μL，其中，模板分別為實驗組樣品反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、對照組樣品反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、陽性及陰性質(zhì)控品反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和標準品；反應(yīng)條件為：37℃，10 min→95℃，15 min→（95℃，15 s→60℃，1 min）。括號內(nèi)條件共重復45個循環(huán)。

圖1 BCSG1質(zhì)粒及其PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

圖2 BCSG1 mRNA實時熒光定量PCR擴增方法的建立

圖3 外周血BCSG1 m RNA的定量檢測

1.2.4 準確性評價 使用本研究所用試劑和參考試劑同時檢測一系列樣品來評價試劑的準確性，參考試劑檢測的結(jié)果作為真實值。準確性用以評價試劑的系統(tǒng)誤差，該指標反映樣品的檢測值和真實值的一致性，以偏差來表示，其計算方法如下：偏差（%）＝（檢測值-真實值）／真實值×100。

1.2.5 檢測特異性分析 取陽性、陰性質(zhì)控品及陽性、陰性企業(yè)標準品各3份，進行提取細胞總RNA，并進行RT-PCR操作，分析檢測結(jié)果與實際情況的相符度。

1.2.6 檢測靈敏度分析 取正常人抗凝外周血8份（3ml／份），分別加入SK-BR-3細胞各0、1、10、100、1×103、1×104、1×105、1×106個，分離有核細胞、提取細胞總RNA，并進行RT-PCR操作，分析實驗結(jié)果，確定最低檢出限。

1.3 統(tǒng)計學處理 實時熒光定量PCR的結(jié)果使用SDS 1.0軟件分析，標準曲線使用回歸分析處理；定量PCR檢測結(jié)果用中位數(shù)顯示，當基因表達水平的檢測結(jié)果為陰性時，該數(shù)據(jù)將被視為“0”以方便統(tǒng)計；陽性率比較使用χ2檢驗。散點圖使用ORIGIN 7.5軟件繪出并分析。

2 結(jié)果

2.1 BCSG1質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 （1）BCSG1質(zhì)粒的構(gòu)建：使用Trizol試劑提取SK-BR-3細胞的總RNA，并經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，總RNA電泳條帶呈彌散型分布，28S、18S rRNA條帶亮度比值約為2∶1，說明RNA完整性較好；之后進行RTPCR反應(yīng)，擴增得到166 bp大小的BCSG1基因目的片段；利用膠回收試劑盒純化PCR擴增產(chǎn)物，并與T載體連接、細菌轉(zhuǎn)化、涂板、挑選5個陽性克隆、擴增培養(yǎng)及提取質(zhì)粒；使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測鑒定質(zhì)粒，結(jié)果如圖1所示。

（2）BCSG1質(zhì)粒的鑒定：將BCSG1質(zhì)粒進行PCR擴增，產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果表明各質(zhì)粒中均含有相應(yīng)目的DNA片段，產(chǎn)物特異性好（圖1）。取3號陽性克隆進行大量培養(yǎng)、提取質(zhì)粒、稀釋10倍后測定260 nm和280 nm吸光值并計算質(zhì)粒溶液的濃度（copies／μL），使用美國Applied Biosystems公司的377測序儀對提取的質(zhì)粒進行序列測定。結(jié)果表明，質(zhì)粒中的插入序列與目的片段的理論值完全一致，將上述抽提得到的BCSG1質(zhì)粒使用TE溶液溶解，并稀釋至終濃度為2×107拷貝數(shù)／μL，作為定值標準品。

2.2 BCSG1 mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒的建立

2.2.1 實時熒光定量RT-PCR方法的建立 對BCSG1質(zhì)粒標準品進行倍比稀釋、制備標準曲線，建立實時熒光定量PCR方法檢測BCSG1 mRNA表達量的方法。結(jié)果表明，BCSG1 mRNA定量用標準曲線較為理想，PCR擴增效率為99%（圖2A），并且選取具有代表性的外周血標本，對其定量PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果表明，擴增條帶特異性好，產(chǎn)物大小與設(shè)計產(chǎn)物大小相同，并且BCSG1在相應(yīng)標本中的表達亦與理論情況相符，BCSG1 mRNA在乳腺癌癌患者的外周血樣品中有表達，而在正常人、乳腺良性疾病患者外周血中均無表達；βactin mRNA在各樣品中均有表達（圖2B）。綜上所述，利用本研究所建立的實時熒光定量RT-PCR方法檢測外周血標本中BCSG1及β-actin mRNA的表達量是可行的。

2.2.2 優(yōu)化BCSG1 mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒組份 （1）陽性、陰性質(zhì)控品的制備：陽性質(zhì)控品為含有BCSG1 mRNA的總RNA，陰性質(zhì)控品為不含BCSG1 mRNA的總RNA，按照Trizol試劑盒方法提取SK-BR-3細胞及K562細胞總RNA，將提取到的總RNA分別用無RNA酶的水溶解至終濃度為0.2 μg／μL，取5 μL RNA樣品加入1 ml無水乙醇中，-20℃保存。

（2）試劑盒組成：10人份／盒，每盒中各組分的量為：PCR管（17個）、紅細胞裂解液1瓶（20 mL／瓶）、無RNA酶水1瓶（8 mL／瓶）、RNA提取液1瓶（10 mL／瓶）、dNTP混合物1管（6.0 μL／管）、逆轉(zhuǎn)錄酶儲存液1管（3.0 μL／管）、反轉(zhuǎn)錄緩沖液1管（33 μL／管）、PCR反應(yīng)緩沖液1管（251.75 μL／管）、UNG酶儲存液1管（4.75 μL／管）、引物對和探針1管（28.5 μL／管）、標準品1管（10 μL／管）、陽性質(zhì)控品1管（1.0 μg／管）、陰性質(zhì)控品1管（1.0 μg／管）。

2.3 BCSG1 mRNA實時熒光定量RT-PCR檢測試劑盒性能評價

2.3.1 檢測準確性 使用Trizol試劑、Invitrogen公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑，ABI公司的熒光定量PCR試劑作為參考試劑，與本研究所建立的試劑盒一同檢測含有BCSG1 mRNA的表達的樣品，3次重復試驗結(jié)果顯示，本試劑盒的標準偏差均在±3%之內(nèi)。

2.3.2 檢測特異性 使用本研究所建立的試劑盒對質(zhì)控品及企業(yè)標準品進行檢測，三次結(jié)果顯示，陽性質(zhì)控品及企業(yè)標準品均檢測出BCSG1 mRNA的表達，陰性質(zhì)控品及企業(yè)標準品未檢測出BCSG1 mRNA的表達，因此，本試劑盒的檢測特異度為100%。

2.3.3 檢測靈敏度 利用本試劑盒檢測含有SKBR-3細胞的樣品，靈敏度為＞100copies／mL全血。

2.3.4 穩(wěn)定性研究 將本試劑盒分別保存于4℃和-20℃，定期測定其準確性、特異性和靈敏度，評價試劑盒的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，試劑盒保存在4℃下，1到4個月，其準確性、特異性和靈敏度保持不變，5個月，準確性、特異性和靈敏度下降，6個月試劑盒失效；保存在-20℃環(huán)境下，1到12個月，其準確性、特異性和靈敏度保持不變，故保存于-20℃環(huán)境中試劑盒有效期至少一年。

2.4 外周血中BCSG1 mRNA的定量檢測 利用本試劑盒檢測外周血樣品，結(jié)果表明，12臨床已確診轉(zhuǎn)移的腫瘤患者外周血樣品均檢測到BCSG1 mRNA的表達，21例臨床未確診轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中12例為陽性，其余9例為陰性，15例乳腺良性疾病患者、10例正常人均為陰性，未檢測到BCSG1 mRNA的表達（圖3），臨床已確診轉(zhuǎn)移的腫瘤患者外周血樣品中BCSG1 mRNA陽性率及表達量均明顯高于未確定轉(zhuǎn)移患者、乳腺良性疾病患者及正常人（P＜0.05）。

3 討論

目前，乳腺癌的治療方法有多種，如手術(shù)、放療、化療及生物治療等，但高復發(fā)和轉(zhuǎn)移率已成為阻礙腫瘤患者生存期提高的主要原因。血行播散是腫瘤轉(zhuǎn)移的主要途徑之一，由于自然或侵襲性醫(yī)源性因素，癌細胞可從原發(fā)灶脫落形成循環(huán)腫瘤細胞，但是由于受檢測方法靈敏度及特異性較低的限制，該微量的癌細胞未能被檢測到，這些癌細胞隨血液到達外周組織并處于休眠狀態(tài)，當患者機體免疫功能下降時，休眠的癌細胞就有可能被激活，從而導致了乳腺癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移［1-2］，循環(huán)腫瘤細胞的數(shù)量與乳腺癌的進展及患者生存期等密切相關(guān)［3］。若能及早發(fā)現(xiàn)并確定循環(huán)腫瘤細胞的存在，將對乳腺癌的診斷、預后和治療產(chǎn)生重要影響，可以指導臨床治療方案的制定。檢測外周血中腫瘤細胞基因及特異性標志物表達是確定腫瘤轉(zhuǎn)移情況的一種有效方法，對腫瘤形成及轉(zhuǎn)移的診斷具有極大的幫助，但是在腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的早期，外周血中的腫瘤細胞一般很少，無法完全依賴病理形態(tài)檢查，未形成轉(zhuǎn)移灶或轉(zhuǎn)移灶未達到一定體積時，影像學診斷也無能為力。因此，循環(huán)血中的微量腫瘤細胞基因表達和一些特異性產(chǎn)物檢測的研究，引起了學者們的廣泛關(guān)注。循環(huán)腫瘤細胞中特異性基因mRNA的定量測定，有利于腫瘤的早期診斷，治療方案的確定以及預后的判斷。隨著分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展及其在醫(yī)學研究中的廣泛應(yīng)用，通過RT-PCR技術(shù)檢測外周血中微量腫瘤細胞已成為可能并被嘗試。實時熒光定量PCR技術(shù)是一種能夠準確定量mRNA的檢測方法，通過檢測腫瘤特異性基因mRNA的表達以判斷循環(huán)腫瘤細胞的存在［4-5］。

BCSG1是一種特異性的在乳腺癌中選擇性表達的基因，其定位于人類染色體10q23，DNA長度約5 kb。BCSG1基因編碼合成1條含127個氨基酸的蛋白，其在乳腺癌組織中特異性表達，在正常乳腺或良性乳腺病變中幾乎不表達，是一種與乳腺癌進展有關(guān)的腫瘤標記物［6］。BCSG1基因的表達與腫瘤分期、淋巴結(jié)浸潤、腫瘤體積及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，在III／IV期乳腺癌中BCSG1的陽性率為71.4%或81%，I／II患者中陽性率為26.8%或15%，BCSG1陽性的乳腺癌患者其生存期較BCSG1陰性患者明顯縮短［7-8］。正常人外周血BCSG1 mRNA呈陰性；游離于細胞外的mRNA很不穩(wěn)定，極易被RNA酶解，故在外周血中若測得BCSG1 mRNA，則提示血循環(huán)中存在有完整的乳腺癌細胞，但目前尚沒有合適的陽性率高的檢測技術(shù)。

在本研究中，我們建立和完善了利用實時熒光定量RT-PCR檢測BCSG1 mRNA的技術(shù)方法及試劑盒（圖1，2），優(yōu)化了試劑盒中的引物、探針；成功制備了定值標準品；通過設(shè)立陽性、陰性質(zhì)控品的方法，解決了試劑盒的特異性、靈敏性、準確性及質(zhì)量控制等關(guān)鍵技術(shù)問題，并對該試劑盒的準確性、靈敏度、特異性及穩(wěn)定性等進行了分析評價，結(jié)果表明，該試劑盒的特異度及準確性均為95%以上，靈敏度為100拷貝／mL（全血），穩(wěn)定性較好，在-20℃中保存12個月其性能未發(fā)生變化。同時，我們利用該試劑盒對外周血標本中BCSG1 mRNA的表達量進行了檢測，結(jié)果表明，12例臨床確診已轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者檢測結(jié)果均為陽性，21例臨床未確診轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中12例為陽性，其余9例為陰性；15例乳腺良性疾病患者、10例正常人均為陰性，未檢測到BCSG1 mRNA的表達，臨床確診已轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者外周血中BCSG1 mRNA表達量和陽性率明顯高于未確診轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者、乳腺良性疾病患者及正常人（圖3）。由此可推測外周血樣品中BCSG1 mRNA的表達量與患者的臨床分期等密切相關(guān)，是一項較好的血源性乳腺癌細胞的監(jiān)測指標，可作為乳腺癌患者診療過程中的重要監(jiān)測指標。利用本研究所建立的試劑盒檢測乳腺癌患者血中的BCSG1 mRNA的表達量，對判斷乳腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復發(fā)，治療效果評價及病情的動態(tài)觀察具有重要意義。

（本文圖1～3見插圖1-2）

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Establishment and application of a detection kit for human breast cancer-specific gene 1 mRNA by real-time quantitative RT-PCR

CHEN Min*，SHEN Guodong，BIAN Geng，XU Tingjuan，XU Weiping，SHEN Gan，HU Shilian（*Anhui Province Hospital Affiliated Anhui Medical University，Hefei 230001，China）

HU Shilian，Email：hushilian＠263.net

ObjectiveThis study was to establish a quantitative method for human breast cancer-specific gene 1（Breast cancer-specific Gene 1，BCSG1）mRNA by real-time RT-PCR.Its application was further evaluated by detecting circulation tumor cells in the peripheral blood of breast cancer patients.MethodThe concentration of each component in the detection kit was optimized；the stability，sensitivity and specificity were determined.The expression level of BCSG1 mRNA was detected in the samples of peripheral blood.ResultsOptimized primers and probes were obtained，and setting standards were successfully prepared.Through establishing the positive and negative control materials，the specificity，sensitivity，accuracy and quality control were determined for the detection kit.The specificity and accuracy were both more than 95%，and the sensitivity was of 100 copies／ml（whole peripheral blood）.The detection results of BCSG1 mRNA in peripheral blood samples showed that all the samples were positive for 12 breast cancer patients clinically diagnosed with metastasis；and 12 samples were positive and other 9 samples were negative among 21 breast cancer patients without clinically diagnosed with metastasis or not；all the samples were negative for 15 patients with benign breast disease；and all the samples were negative for 10 healthy control.Conclusion The quantitative RT-PCR assay for BCSG1 mRNA could be used for the detection of circulating tumor cells in peripheral blood of breast cancer patients，which would be valuable for the diagnosis and clinical-decision making for breast cancer patients.

Breast neoplasms；Reagent kits，diagnostic；RNA，messenger；Reverse transcriptase polymerase chain reaction

R446

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.01.023

2013-04-27）

國家自然科學基金面上項目（81071808）；安徽省國際科技合作項目（10080703037）；安徽省科技攻關(guān)項目（12010402126）；安徽省腫瘤免疫營養(yǎng)診療產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊資助

程民，助理研究員，Email：chengmin＠ustc.edu.cn

胡世蓮，主任醫(yī)師，教授，博士生導師，Email：hushilian＠263.net