天七方對過氧化氫誘導(dǎo)心肌細胞損傷模型核因子E2相關(guān)因子2／抗氧化反應(yīng)元件通路的影響

劉松濤，劉勤，蘇慧，朱洪哲，蘇云明

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，哈爾濱 150040）

天七方對過氧化氫誘導(dǎo)心肌細胞損傷模型核因子E2相關(guān)因子2／抗氧化反應(yīng)元件通路的影響

劉松濤，劉勤，蘇慧，朱洪哲，蘇云明

（黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，哈爾濱 150040）

目的探討天七方（TQ）對過氧化氫（H2O2）所致心肌細胞損傷的核因子E2相關(guān)因子2／抗氧化反應(yīng)元件（Nrf2／ARE）通路的影響，闡明TQ抗心肌損傷的分子機制。方法建立H2O2誘導(dǎo)的心肌損傷模型，通過MTT法觀察在不同濃度TQ的干預(yù)下，對心肌細胞增殖作用的影響，Western blot法檢測Nrf2／ARE通路相關(guān)蛋白表達情況。結(jié)果與空白組相比，TQ對心肌細胞無明顯損傷，并且TQ可減少H2O2所導(dǎo)致心肌細胞損傷（P＜0.01）。此外，TQ可上調(diào)蛋白Nrf2和HO-1的表達。結(jié)論TQ通過激活Nrf2／ARE通路，增加蛋白HO-1的表達，抑制H2O2所致的心肌細胞的氧化損傷。

冠心病；肌細胞，心臟；過氧化氫；紅景天；三七；鼠

圖1 各組心肌細胞Nrf2和HO-1蛋白的表達

隨著人們生活水平的不斷提高，人口平均壽命的延長，缺血性心臟病（又稱冠心病，CAD）的發(fā)病率不斷上升，已經(jīng)成為當(dāng)今世界威脅人類健康的主要疾病之一［1］。

中藥復(fù)方天七方（TQ）由紅景天、三七、柴胡和太子參組成，是黑龍江省著名老中醫(yī)劉勤教授運用中醫(yī)理論，結(jié)合幾十年的臨床經(jīng)驗精心研制并總結(jié)出的用于治療冠心病，心肌缺血的經(jīng)驗方。本文從分子水平深入闡明天七方抗心肌缺血的作用機制，為其臨床的應(yīng)用和推廣提供堅實的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級SD雄性乳鼠（24 h），由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

1.2 藥物 紅景天、三七、柴胡和太子參，各藥物加水浸泡30min，先加藥量8倍的水，沸騰后煎40min，過濾取汁，再加8倍的水，沸騰后煎30 min，合并2次濾液濃縮并減壓干燥，研制成粉末。

1.3 試劑 DMEM細胞培養(yǎng)基（Invitrogen，美國），標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Gibco，美國），0.25%胰酶消化液（Hyclone，美國），雙抗（Penicillin-Streptomycin Solution，Hyclone，美國）。過氧化氫（H2O2，北京化工廠），二甲基亞砜（DMSO，Sigma，美國）。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素氧合酶（HO-1）和β-actin（Santa CruzBiotechnology，美國），辣根過氧化物酶偶聯(lián)山羊抗小鼠抗體（康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京）。哺乳動物蛋白抽提試劑、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒和高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京）。

1.4 儀器 熒光正置顯微鏡DM4000B（Leica，德國），二氧化碳細胞培養(yǎng)箱Heraeus BB15（Thermo Scientific，美國），超凈工作臺ZHJH-C1115B（上海智成分析儀器制造有限公司），立式壓力蒸汽滅菌器（江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司），低溫離心機Labofuge 400R（Thermo Electron，德國），凝膠成像系統(tǒng)ChemiDOCTMXRS＋（Bio-RAD，美國）。

1.5 實驗方法

1.5.1 心肌細胞的分離與培養(yǎng) 新生大鼠75%乙醇消毒皮膚，迅速開胸，無菌條件下取心室肌，放入PBS液中清洗2～3次，放入無血清的DMEM培養(yǎng)液中，剪成1～1.5 mm3的碎塊，移入離心管中，1 000 r／min離心3 min，棄上清，加入0.08%的胰酶置于37℃水浴中，消化6～7次，每次消化10 min。前2次棄上清，從第3次起收集心肌細胞，過200目篩，1 000 r／min離心5 min后加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液制成細胞懸液，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，以差速分離法去除已貼壁的成纖維細胞，取上清液計數(shù)并稀釋細胞密度為1×105個／L。接種于96孔板，每孔100μL，于37℃、CO2培養(yǎng)箱中靜置貼壁培養(yǎng)。每24小時更換1次培養(yǎng)液，48 h后選生長狀態(tài)良好的心肌細胞分組處理，進行實驗。

1.5.2 細胞存活率測定 96孔細胞培養(yǎng)板接種細胞（5×104個／孔），每組設(shè)4個復(fù)孔，單層融合后，每孔加入100μL MTT（1 g／L），置于37℃、5%CO2孵箱中孵育4 h，取出后棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 mL DMSO，微樣振蕩器震蕩30 min，于酶標(biāo)儀570 nm處讀取吸光度值，計算細胞存活率。

1.5.3 天七方對正常乳鼠心肌細胞的影響 取接種于96孔板培養(yǎng)48 h后的心肌細胞，棄去原培養(yǎng)液。每組設(shè)4個復(fù)孔，空白組每孔加入DEMA培養(yǎng)液100μL，給藥組每孔加入含TQ終濃度分別為5、10、20 mg／L的DEMA培養(yǎng)液100μL，在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測細胞存活率。

1.5.4 H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞損傷模型的建立 取接種于96孔板培養(yǎng)48 h后的心肌細胞，吸棄原培養(yǎng)液。每組設(shè)4個復(fù)孔，空白組每孔加入DMEM培養(yǎng)液100μL；模型組每孔加入H2O2終濃度分別為50、 100、200、400和800μmol／L的DMEM培養(yǎng)液100 μL，在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 h后，采用MTT法檢測細胞抑制率。確定建立H2O2損傷模型的最適條件［2］。

1.5.5 天七方對H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞損傷保護作用的研究 取接種于96孔板培養(yǎng)48 h后的乳鼠心肌細胞，將細胞分成空白組、模型組和TQ組（5、10和20mg／L）。空白組每孔加100μL無血清培養(yǎng)基；模型組，每孔加入含H2O2的DEMA培養(yǎng)液100 μL，終濃度為200μmol／L，放入CO2孵箱，37℃培養(yǎng)；TQ組5、10和20 mg／L各劑量組分別預(yù)孵4 h后，棄上清，加100μL的200μmol／L H2O2作用5 h后，MTT法檢測細胞存活率。

1.5.6 Western blot法檢測Nrf2／ARE通路蛋白的表達 實驗處理終止，收集細胞，PBS清洗細胞2～3次后裂解細胞。裂解時間為30 min。隨后，將裂解液在4℃、12 000 r／min離心15 min，收集上清液，采用BCA蛋白定量法確定蛋白濃度，然后15% SDA-PAGE電泳分離。電泳完畢后，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，并用脫脂牛奶室溫封閉2 h。分別加入相應(yīng)的一抗抗體（Nrf2、HO-1和β-actin），4℃孵育過夜。TBST洗滌后，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌后采用化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白的變化。1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用統(tǒng)計軟件包SPSS 11.5進行統(tǒng)計，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩樣本比較采用配對t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 TQ單獨給藥對心肌細胞的影響 結(jié)果顯示，TQ各劑量組（5、10和20mg／L）預(yù)孵育24 h，與空白組相比，對正常心肌細胞無明顯損傷（P＞0.05），見表1。

表1 TQ對正常心肌細胞增殖的影響（±s，n＝4）

表1 TQ對正常心肌細胞增殖的影響（±s，n＝4）

注：天七方各劑量組預(yù)孵育24 h，與空白組比較，均P＞0.05

組別OD值空白組0.664±0.027 TQ組5 mg／L 0.669±0.021 10 mg／L 0.650±0.034 20 mg／L 0.667±0.038

2.2 H2O2誘導(dǎo)心肌細胞氧化損傷模型的建立MTT實驗結(jié)果顯示：細胞抑制率隨H2O2濃度的升高而增加，當(dāng)200、400和800μmol／L H2O2作用5 h時其細胞抑制率達50%以上，為理想造模條件。綜合考慮選用200μmol／L H2O2作用5 h作為最佳造模條件，見表2。

表2 H2O2誘導(dǎo)心肌細胞損傷模型的建立（±s，n＝4）

表2 H2O2誘導(dǎo)心肌細胞損傷模型的建立（±s，n＝4）

注：與空白組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

組別OD值0.747±0.032 H2O2組50μmol／L 0.763±0.029 100μmol／L 0.667±0.031a200μmol／L 0.601±0.026b400μmol／L 0.528±0.028b800μmol／L 0.343±0.040空白組b

2.3 TQ對H2O2誘導(dǎo)心肌細胞損傷保護作用 TQ預(yù)孵育4 h后，加200μmol／LH2O2作用5 h，細胞活力檢測結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組細胞活力明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，TQ組（5、10和20 mg／L）細胞活力明顯提高（P＜0.01），且TQ對心肌細胞的保護作用呈劑量依賴性，見表3。

表3 天七方對H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞增值的影響（±s）

表3 天七方對H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞增值的影響（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與H2O2（200μmol／L）組比較，bP＜0.01

組別鼠數(shù)（只）OD值空白組4 0.751±0.041 H2O2組（200μmol／L）4 0.601±0.026aTQ組5 mg／L 4 0.643±0.020 10 mg／L 4 0.683±0.028b20 mg／L 4 0.700±0.022b

2.4 TQ調(diào)節(jié)Nrf2／抗氧化反應(yīng)元件（ARE）通路相關(guān)蛋白的表達 與空白組比較，TQ單給藥組Nrf2蛋白無明顯變化，H2O2模型組心肌細胞胞核中的Nrf2蛋白水平卻明顯增高。而TQ預(yù)處理組可抑制心肌細胞中Nrf2在細胞核的聚集，見圖1。同樣，TQ單給藥組與空白組相比，HO-1蛋白表達無明顯變化，而模型組中蛋白表達卻明顯增高。TQ預(yù)處理后可明顯降低HO-1蛋白表達，見圖1。

3 討論

在過去的幾十年里，缺血性心臟病的發(fā)病率和死亡率呈逐漸上升的趨勢。而由于缺血性心臟病的高危因素如糖尿病、肥胖和吸煙等人群增多以及老齡人口的增多，可預(yù)見未來缺血性心臟病對人類健康的威脅［3］。雖然目前對于缺血性心臟病的治療如藥物治療及冠脈介入治療等取得了較好的療效，但仍存在一定的問題［4］。藥物治療易產(chǎn)生不良反應(yīng)，介入治療可導(dǎo)致繼發(fā)性損傷，而傳統(tǒng)中藥因其臨床有效性和其可靠的安全性而逐漸得到醫(yī)學(xué)工作者的認(rèn)可。

Nrf2是屬于CNC（Cap＂n＂collar）家族的一類具有堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（bZIP）的轉(zhuǎn)錄因子CNC家族還包括P45、Nrfl、Nrf3、Bachl和Bach2［5-6］。ARE是在Nrf2被發(fā)現(xiàn)之前，在分析谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）Ya亞單位的啟動子序列時分別由兩個獨立的團隊發(fā)現(xiàn)，分別命名為抗氧化反應(yīng)原件和親電子反應(yīng)原件（EPRE）［7-8］。HO-1是具有誘導(dǎo)功能的HO亞型。在血紅素增加、Nrf2／ARE通路激活、促氧化劑、炎癥刺激及應(yīng)激狀態(tài)下心肌細胞表達HO-1都明顯增加［9］。在我們的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，H2O2明顯增強心肌細胞中Nrf2的核轉(zhuǎn)錄及HO-1的蛋白表達，而天七方預(yù)處理卻可明顯降低Nrf2的核轉(zhuǎn)錄及HO-1的蛋白表達。

（本文圖1見插圖2-2）

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Protective effects of TianQi Formula against H2O2-induced apoptosis via Nrf2／ARE passway in cardiocytes

LIU Songtao，LIU Qin，SU Hui，ZHU Hongzhe，SU Yunming（Department of Pharmacy Institute of Basic Medical Sciences Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China）

Corresponding anthor：SU Yunming，Email：χubingqing1＠163.com

ObjectiveTo study the effectof TianQi Formula（TQ）on the protection of H2O2-induced cardiocytes apoptosis via Nrf2／ARE passway，and to explore themechanism of protection.MethodsThemodel of H2O2-induced apoptosis of cardiocytes was used to determine the protective effects of TQ（MTT）.The expression of Nrf2／ARE-related proteinswas determined with Western blotting assay.Result Compared with normal group，TQ of the different dose alone showed no cytotoxicity and had significant protective effects against H2O2-induced apoptosis of cardiocytes in a dose-dependentmanner（P＜0.01）.Moreover，TQ significantly strengthened the protein expression of Nrf2 and HO-1.ConclusionTQ can prevent H2O2-induced apoptosis in cardiocytes，themechanism mightbe related to the regulation of Nrf2／ARE passway.

Coronary disease；Myocytes，cardiac；Hydrogen peroxide；Rhodiola sacra；Panax notoginseng；Rat

R541.4

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.02.019

2014-01-10）

劉松濤，博士在讀，Email：shuzunpeng2010＠163.com

蘇云明，博士生導(dǎo)師，教授，Email：xubingqing1＠163.com