細(xì)胞色素P450酶17基因多態(tài)性與遲發(fā)型男性性腺功能減退癥的相關(guān)性研究

李保山，宋青青，朱翔，沈國棟，喬潔，任安，康冬梅

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，a干部病房，b老年醫(yī)學(xué)研究所，c內(nèi)分泌科，合肥 230001；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院內(nèi)分泌科）

細(xì)胞色素P450酶17基因多態(tài)性與遲發(fā)型男性性腺功能減退癥的相關(guān)性研究

李保山1a，宋青青1a，朱翔1a，沈國棟1b，喬潔2，任安1c，康冬梅1a

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院，a干部病房，b老年醫(yī)學(xué)研究所，c內(nèi)分泌科，合肥 230001；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院內(nèi)分泌科）

目的探討細(xì)胞色素P450酶17（CYP17）基因多態(tài)性與遲發(fā)型男性性腺功能減退癥（LOH）的關(guān)系，研究LOH的發(fā)病機(jī)制。方法納入年齡在49～79歲的中老年男性356例，其中36例診斷為遲發(fā)性性腺功能減退癥患者，隨機(jī)抽取130例正常健康中老年男性，測(cè)量身高、體質(zhì)量、腰圍（WC）、血壓，測(cè)定三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、空腹血糖（FBG）、血清總睪酮（T）、雌二醇（E2），并應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)檢測(cè)CYP17基因多態(tài)位點(diǎn)的片段，產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳確定出CYP17基因型，比較兩組各指標(biāo)之間的差異。結(jié)果CYP17基因呈多態(tài)性：A1／A1、A1／A2和A2／A2。正常健康中老年男性的SBP、BMI、TG、TC和，F(xiàn)BG較LOH患者低（P＜0.05），而T和T／E2比值較LOH組顯著升高（P＜0.01），兩組間E2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。正常健康中老年男性組CYP17不同基因型之間T和T／E2比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；LOH組CYP17不同基因型之間T和T／E2比值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），兩組不同基因型之間E2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。LOH組較正常健康中老年男性組CYP17基因雜合變異型A1／A2呈現(xiàn)低頻率分布（33.3%），而純合變異型A2／A2呈高頻率分布（47.3%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論CYP17基因多態(tài)性可能與LOH患者的T水平有關(guān)，低水平的T和T／E2比值可能是LOH發(fā)病的危險(xiǎn)因素。

性腺功能減退癥；類固醇17-α-羥化酶；多態(tài)性，單核苷酸；危險(xiǎn)因素

隨著全球人口老齡化的進(jìn)展，中老年男性健康問題成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問題。而遲發(fā)性性腺功能減退癥（LOH）起病隱匿，更成為醫(yī)療工作者重點(diǎn)關(guān)注的疾病之一，其病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚未明確［1-2］。衰老過程中造成中老年男性細(xì)胞色素P450酶17（CYP17）基因的變異可能與LOH有關(guān)。本研究擬通過探討CYP17基因多態(tài)性與LOH的相關(guān)性，分析CYP17基因多態(tài)性在LOH發(fā)病過程中的作用。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2012年1月至2012年12月在安徽省立醫(yī)院體檢的40～79歲中老年男性356例，平均年齡（59.4±7.7）歲。測(cè)量身高、體質(zhì)量、腰圍（WC）、血壓（BP），測(cè)定三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、空腹血糖（FBG）、血清總睪酮（T）、雌二醇（E2），同時(shí)采用AMS量表（the Aging Male Symptoms Scale）電話問卷調(diào)查后，診斷為L(zhǎng)OH者36例。隨機(jī)抽取130例正常健康中老年男性作為健康對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①40～79歲安徽本地中老年男性居民；②自愿接受問卷和血液學(xué)檢查者；③LOH陽性診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《2011年LOH診療指南》標(biāo)準(zhǔn)：相關(guān)臨床癥狀評(píng)分達(dá)標(biāo)同時(shí)伴血清睪酮水平低下的切點(diǎn)值：T≤11.5 nmol／L。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近期（3個(gè)月）內(nèi)接受過激素治療；②肝腎功能不全；③腫瘤患者；④嚴(yán)重酗酒者；⑤體質(zhì)量指數(shù)（BMI）＞30。正常人群組130例為相關(guān)臨床癥狀評(píng)分和血清T水平均在正常范圍。所有入選者均為安徽本地人群，研究個(gè)體之間無血緣關(guān)系，并簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集 上午8：00～9：00留取靜脈血，總量10 mL；2 mL直接分離血清在生化實(shí)驗(yàn)室全自動(dòng)生化分析儀測(cè)空腹血糖（FBG）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）；4 mL分離血清由德國西門子公司全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（型號(hào)：650102）測(cè)定睪酮（T）、雌二醇（E2）；4 mL以EDTA抗凝，凍存于-80℃冰箱，以提取DNA。

1.3 外周血DNA的提取 靜脈血中分離白細(xì)胞，用全血DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）提取基因組DNA。

1.4 目的片段的PCR擴(kuò)增 多態(tài)性片段PCR擴(kuò)增使用引物為CYP17 F：5′-CATTCGCACCTCTGGAGTC-3′，R：5′-GGCTCTTGGGGTACTTG-3′［3］。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括DNA模板50 ng、引物20 pmol、100μmol dNTPs、1×反沖液、1U Taq聚合酶。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，57℃退火1 min，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用MspA1I在37℃下消化3 h后進(jìn)行酶切。反應(yīng)混合物包括PCR產(chǎn)物15μL、BSA 0.25μL、10×NE Buffer 2.5 μL、內(nèi)切酶MspA 1Ⅰ0.5μL、。酶切反應(yīng)在Eppendorf管中進(jìn)行，2%的瓊脂糖凝膠電泳，鑒定酶切產(chǎn)物。

1.5 DNA測(cè)序 采用標(biāo)記引物的雙脫氧末端終止法，純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA自動(dòng)測(cè)序儀（ABI3730XL）直接測(cè)序?qū)y(cè)序結(jié)果與Genebank數(shù)據(jù)庫中CYP17基因相應(yīng)序列比對(duì)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料運(yùn)用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

表1 入選人群一般情況分析

表3 健康對(duì)照組和LOH組CYP17不同基因型之間激素水平的比較（±s）

表3 健康對(duì)照組和LOH組CYP17不同基因型之間激素水平的比較（±s）

注：A1／A1：野生純合子等位基因；A1／A2：雜合變異體；A2／A2：純合變異體；正常健康中老年男性組CYP17不同基因型之間T、E2和T／E2比值比較，P＞0.05；LOH組CYP17不同基因型之間T和T／E2比值比較，P＜0.05，而不同基因型之間E2比較，P＞0.05

T（nmol／L）組別例數(shù)E2（pmol／L）T／E2A1／A1 A1／A2 A2／A2健康對(duì)照組130 12.94±2.38 13.05±2.36 13.12±2.24 51.57±18.21 52.78±18.34 53.82±18.28 0.25±0.09 0.2 A1／A1 A1／A2 A2／A2 A1／A1 A1／A2 A2／A2 04 0.11±0.02 6±0.01 0.25±0.08 LOH組36 7.65±1.32 7.31±1.29 6.51±1.34 51.34±17.11 52.37±18.31 52.57±17.21 0.15±0.05 0.12±0.

2 結(jié)果

2.1 CYP17基因型 CYP17基因型產(chǎn)物表現(xiàn)出3種類型，即3種基因型，純合子（A1／A1）、雜合子（A1／A2）和純合子（A2／A2）。

2.2 一般情況分析 入選人群分為健康對(duì)照組和LOH組，健康對(duì)照組130例，LOH組36例，兩組之間一般情況比較，見表1。兩組在年齡、WC、舒張壓（DBP）之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而BMI、收縮壓（SBP）、TG、TC、FBG之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 性激素水平比較 LOH組患者T濃度和T／E2比值與健康對(duì)照組相比顯著降低（P＜0.01），而E2水平兩組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 兩組之間性激素水平比較（±s）

表2 兩組之間性激素水平比較（±s）

注：與健康對(duì)照組比較，aP＜0.01，bP＞0.05

組別例數(shù)T（nmol／L）E2（pmol／L）T／E2健康對(duì)照組130 14.12±2.24 51.78±18.34 0.26±0.07 LOH組36 7.66±2.32a52.42±24.78b0.12±0.02a

2.4 CYP17不同基因型之間激素水平的比較 見表3。

表4 兩組CYP17基因型分布和等位基因頻率

2.5 兩組CYP17基因型分布和等位基因頻率與LOH的危險(xiǎn)性 見表4。

3 討論

男性血清T水平與代謝綜合征可能存在一定的聯(lián)系［4］，血清T可能參與調(diào)節(jié)血糖及脂肪代謝，T水平下降可以導(dǎo)致血糖及脂肪代謝紊亂，進(jìn)而誘發(fā)糖尿病、高血壓和血脂升高［5-6］。在本研究中發(fā)現(xiàn)，LOH患者的BMI、SBP、TG、TC和FBG的指標(biāo)高于健康對(duì)照組，這與Svartberg等［6］和Vermeulen等［7］的研究結(jié)果一致。

LOH患者CYP17基因多態(tài)性的研究在國內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，CYP17基因呈多態(tài)性，LOH組雜合變異型A1／A2（33.3%）和純合變異型A2／A2（47.3%）較健康對(duì)照組雜合變異型A1／A2（48.5%）和純合變異型A2／A2（15.3%）有顯著改變（P＜0.05），而且LOH組變異等位基因A2（63.9%）較健康對(duì)照組變異等位基因A2（39.6%）呈高頻率表達(dá)，有顯著性差異（P＜0.05）。同時(shí)，與正常健康中老年男性組相比LOH組CYP17不同基因型之間T和T／E2比值有顯著性差異（P＜0.05），提示CYP17基因多態(tài)性可能與LOH患者T水平有一定的關(guān)系，變異等位基因A2的高表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞色素P450c17A酶結(jié)構(gòu)和功能缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致T的水平降低。

LOH發(fā)病機(jī)制目前仍不是十分清楚，表現(xiàn)為男性老齡化及伴隨雄激素水平下降，并且其發(fā)病受遺傳和環(huán)境等多方面因素影響［8］，而CYP17基因多態(tài)性與LOH關(guān)系的研究目前還處于起步階段［9-11］。本研究結(jié)果顯示，LOH患者CYP17基因呈現(xiàn)變異等位基因A2高頻率，初步推測(cè)CYP17基因突變可能與LOH發(fā)病有關(guān)，突變等位基因A2導(dǎo)致的T水平和T／E2比值降低可能是LOH的發(fā)病因素，但仍需要大量的研究進(jìn)一步的證實(shí)。

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The association between polymorphism of CYP17 gene and late-onset male hypogonadism

LI Baoshan*，SONGQingqing，ZHU Xiang，SHEN Guodong，QIAO Jie，REN An，KANG Dongmei（*CadresWard，Anhui Provincial Hospital Affiliated to Anhui Medical University，Hefei230001，China）

KANG Dongmei，Email：kangdongmei2006＠sina.com

ObjectiveTo investigate the association between the polymorphisms in CYP17 gene with lateonsetmale hypogonadism（LOH）and explore the pathogenesis of LOH.MethodsThe investigation involved 356men aged 40-79 years，including 36 caseswith LOH.130 healthymiddle-agedmaleswere random ly selected.The body mass index（BMI），height，waist circum ference（WC）and blood pressure weremeasured and the levels of Triglyceride（TG），serum total cholesterol（TC），fasting blood glucose（FBG），serum total testosterone（T），serum estradiol（E2）were also detected.The polymorphisms of CYP17 gene were examined by PCR.ResultsThe polymorphisms of CYP17 gene were A1／A1，A1／A2 and A2／A2.Themean SBP，BMI，TG，TC and FBG in the healthy males were significantly lower（P＜0.05），whileT and T／E2ratio weremarkedly higher compared with the LOH males（P＜0.01），There was no significant difference in the level of E2between the two groups（P＞0.05）.There were no significant difference in the levels of serum T and T／E2ratio of the different CYP17 genotypes in the normalmiddle-aged males（P＞0.05），while significant difference was found in the different CYP17 genotypes in LOH males（P＜0.05），and there was no significant difference in the level of E2in the different CYP17 genotypes between the two groups（P＞0.05）.Heterozygous variants（A1／A2）of CYP17 were present in less frequency（33.3%）and homozygous（A2／A2）variants were higher frequently（47.3%）found in LOH，and the results were significant（P＜0.05）.ConclusionPolymorphisms in CYP17 genemay be associated with serum T concentrations in LOH cases，and low levels of serum T and T／E2ratiomight possibly act as risk factors for LOH.

Hypogonadism；Steroid 17-alpha-Hydroxylase；Polymorphism，Single Nucleotide；Risk Factors

R588

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.02.011

2014-01-04）

安徽省2008年度重點(diǎn)科研計(jì)劃（08020303073）；安徽省科技計(jì)劃項(xiàng)目（12010402134）

李保山，碩士在讀，Email：lbs622＠163.com

康冬梅，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：kangdongmei2006＠sina.com