HPLC-UV法測定草決明中五種蒽醌類化合物含量及其指紋圖譜的建立*

何永志，嚴治學，Ernestina Amponsem，任曉亮，常艷旭

(天津中醫(yī)藥大學中藥學院，天津 300193)

決明子是一味眾所周知的具有潤腸通便功能的中藥［1］，具有調(diào)節(jié)血液和膽固醇作用，可用于治療高血壓、糖尿病、月經(jīng)不調(diào)、水腫等疾病。望江南在中國稱為草決明，在中國南方局部地區(qū)用于腸道和皮膚等病的治療［2］。而在加納，草決明則用于治療高血壓、瘧疾、傷寒、咳嗽等疾病［3，4］。現(xiàn)代研究表明，草決明含有多種化學成分，如蒽醌類(番瀉葉苷A，B和C，蘆薈大黃素，大黃酚，大黃素，大黃酸等)，三萜類、鞣質(zhì)、黃酮類、油脂、毒白蛋白素和多糖等［5］。有學者對源自湖北省和南京市的草決明的蒽醌含量進行了研究，發(fā)現(xiàn)湖北省的草決明蒽醌含量最高，且炮制時間和溫度會影響揮發(fā)性成分的含量［6，7］，而在加納北方邦西部也出現(xiàn)過兒童因過量食用草決明而引起中毒的相關(guān)報道［8］。目前對于決明子質(zhì)量控制研究往往集中一個或幾個成分的定性或定量分析，或采用雙波長HPLC指紋圖譜結(jié)合化學計量分析法鑒別炒決明子、生決明子和小決明子。而以多組分為基礎(chǔ)的測定草決明的化學計量學分析方法研究尚未見報道。為控制藥材質(zhì)量，保證用藥安全，本文根據(jù)草決明所含化學成分特性，對來自加納和中國不同產(chǎn)地的22個草決明子樣本中五種蒽醌類成分進行含量測定，并建立HPLC指紋圖譜，為草決明的全面質(zhì)量評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器：島津(日本東京)二元LC－20AT泵，SIL20A自動進樣器，CTO－10ASvp柱溫箱，SPD－20A紫外檢測器，CMB－20A系統(tǒng)控制器。

1.2 試藥：蘆薈大黃素(＞98.0%)，大黃酸(＞98%)，大黃素(＞99%)，大黃酚(＞99%)和大黃素甲醚(＞98.4%)購自中國藥品生物制品檢定所。草決明樣品產(chǎn)自加納11個不同地區(qū)以及中國兩個地區(qū)(武漢和南京)，并經(jīng)李天祥副教授鑒定，標本保存于天津中醫(yī)藥大學實驗室標本部(見表1)。乙腈和甲醇(色譜純)購自天津江天化工有限公司;甲酸(分析純)購自天津柯偉有限公司。純凈水購自杭州娃哈哈集團有限公司。

表1 草決明樣品

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件：采用 Hypersil C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm，P.R)，流動相：0.05%甲酸(A)－乙腈(B)，梯度洗脫：0-50min，5%B-90%B;流速 1.0mL/min，檢測波長 254nm，柱溫30℃，進樣量20μL。生品(NR)、炒品(R)和5個標準品混合物HPLC色譜圖如圖1所示。

2.2 溶液的制備：標準品溶液的制備：取蘆薈大黃素(1mg)、大黃酸(1mg)、大黃素(1mg)、大黃酚(1mg)和大黃素甲醚(5mg)精密稱定，分別置于10mL的容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚分別為100μg/mL、100μg/mL、100μg/mL、100μg/mL、100μg/mL、500μg/mL的標準品溶液。樣品溶液的制備：采用傳統(tǒng)炒制法進行炮制，在預(yù)熱的平底鍋(170－190℃)中將80g草決明種子煨炒4min，粉碎，過4號篩。取草決明粉末樣品(0.2g)精密稱定，置10mL容量瓶中加甲醇/水(4∶1)10mL。記錄容量瓶質(zhì)量，室溫下將混合物超聲萃取40min，補足失重。提取液經(jīng)微孔濾膜(0.45m)過濾，取續(xù)濾液，待用。

圖1 生品(NR)、炒品(R)和5個標準品混合物

2.3 方法驗證：精密量取5個蒽醌類化合物的標準品溶液適量，混合均勻，并逐級稀釋繪制標準曲線，采用最小二乘法對每個蒽醌類化合物進行線性回歸分析，結(jié)果表明線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2＞0.996)。精密度由同一天同一樣品重復進樣6次測定，峰面積和保留時間的相對標準偏差(RSD，n=6)分別小于2.5%和0.1%(表3)。重復性通過分析6個平行制備的樣品進行評價。穩(wěn)定性通過分析相同混合標準溶液在室溫下24h的含量進行評價。加樣回收試驗結(jié)果表明，方法回收率介于95.6%-104.1%之間，RSD 小于6.2%。結(jié)果見表2。

表2 方法驗證結(jié)果 (RSD%)

2.4 含量測定：按“2.2”項下方法制備樣品溶液，經(jīng)微孔濾膜 (0.45μm)過濾，進樣分析。結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地樣品中蒽醌含量測定結(jié)果 (μg/mL)

2.5 草決明的HPLC指紋圖譜的建立：按“2.2”項下方法分別制備22個草決明藥材的樣品溶液，并按“2.1”項下方法進樣分析。比較各樣品色譜圖發(fā)現(xiàn)，不同樣品具有相似的化學成分，在HPLC指紋圖譜中，指認了5個色譜峰：①蘆薈大黃素，②大黃酸，③大黃素，④大黃酚和⑤大黃素甲醚，保留時間分別為31.7，32.5，38.1，43.7，46.7min。色譜峰 9 在色譜圖上響應(yīng)最高且保留時間適宜，因此選取作為參比峰。其中7個產(chǎn)自加納的生品均有相應(yīng)炮制品，分析生品(1組)和炮制品(兩組)色譜圖，除了產(chǎn)自Adum Banso和Ahinsan的樣品，每組5個樣品都顯示了大量共有色譜峰的存在，因此采用軟件進行色譜峰匹配，結(jié)果5個生品樣品顯示有16個共有峰，5個炮制樣品顯示有8個共有峰。如圖2所示。

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004 A)”，對產(chǎn)自加納5個生品及與中國產(chǎn)生品進行相似度判別，結(jié)果見表4、5。

表4 共有峰相對峰面積和保留時間及5個樣品的相似度

表5 加納和中國草決明生品指紋圖譜的相似性

3 討論

本實驗建立了一種對草決明中的多個蒽醌類成分進行質(zhì)量控制的簡單可靠的HPLC法，同時建立的草決明指紋圖譜標準，為該藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

3.1 色譜條件的優(yōu)化和提取方法的選擇：為全面反映草決明藥材HPLC信息，對提取溶劑和提取時間進行了考察，結(jié)果表明采用甲醇水溶液提取效果較好，并通過L9(34)正交試驗，考察甲醇/水在20∶80、50∶50、80∶20時超聲提取效果。同時對色譜條件進行優(yōu)化，比較甲醇、乙腈、甲酸、磷酸和水以不同比例作為流動相，結(jié)果表明乙腈比甲醇有更好分離效果;檢測波長在254nm和278nm時具有相似的色譜圖，但278nm下大黃素甲醚響應(yīng)較弱，因此選取254nm作為檢測波長;流速為1mL/min時，50min內(nèi)具有良好分離效果。

3.2 指紋圖譜的應(yīng)用：產(chǎn)自O(shè)kponglo sonitra的炮制品在加納的11個樣品中蒽醌類化合物含量最高。與產(chǎn)自土壤條件相似的Physic garden(KNUST)樣品相比，相似度可達0.955;與兩個產(chǎn)自中國的炮制品相比，相似系數(shù)分別為南京(0.215)、武漢(0.335)。表明產(chǎn)自兩個國家的樣品具有顯著的差異。

3.3 生品和炮制品的使用的差別：比較生品和炮制品的色譜峰的差別，結(jié)果色譜圖上共有34個色譜峰。其中5個色譜峰為生品特有，但炒制后都消失。炒制后產(chǎn)生19個新的色譜峰，其它有8個色譜峰吸收增強，2個色譜峰吸收下降。推測新色譜峰可能是在炒制過程中經(jīng)氧化或分解產(chǎn)生。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.134-135.

［2］南京中醫(yī)藥大學.中藥大辭典［M］.第2版.上海：上海科學技術(shù)出版社，2006.3133-3134

［3］Chu C，Hao Z，Wei X，et al.2007.High－performance liquid chromatographicngerprint analysis for different origins of sea buckthorn berries［J］.Journal of Chromatography A，1154：250－259.

［4］Dalziel JM，1956.Useful plants of west tropical africa［M］.Crown Agents for Overseas Governments，London，179-183.

［5］Pellati F，Benvenuti S，Magro L，Melegari M，Soragni F.Analysis of phenolic compounds and radical scavenging activity of Echinacea SPP［J］.Pharm Biomed Anal，2004，35(2)：289.

［6］Jain S Patil UK.Phytochemical and pharmacological profile of cassia tora Linn［J］.Indian Journal of Natrual Products and Resources，2010，1(4)：430-437.

［7］Jawahar La，Gupta PC.Anthraquinone glycoside from the seeds of cassia occidentalis Linn［J］.Specialia，Allahabad(India)，1972，15(2)：141-142.

［8］Sadique J.Biochemical modes of action of cassia occidentalis and cardiospermum halicacabum in inflammation［J］.Ethnopharamacol，1987，19(2)：201-212.