泥蚶血紅蛋白的制備及其抗菌活性研究

王素芳，包永波，施淼江，鄭丹妮，楊婷婷，林志華

（1.寧波大學海洋學院，浙江寧波 315211；2.浙江萬里學院浙江省水產種質資源高效利用技術研究重點實驗室，浙江寧波 315100）

泥蚶血紅蛋白的制備及其抗菌活性研究

王素芳1，2，包永波2*，施淼江2，鄭丹妮2，楊婷婷1，2，林志華2

（1.寧波大學海洋學院，浙江寧波 315211；2.浙江萬里學院浙江省水產種質資源高效利用技術研究重點實驗室，浙江寧波 315100）

利用凝膠層析技術從泥蚶血細胞裂解物中分離純化得到兩種血紅蛋白，回收率為74.3%，并通過Tricine-SDS-PAGE和質譜技術鑒定為Tg-HbⅠ（同源二聚體）和Tg-HbⅡ（異源四聚體）。分別通過瓊脂擴散法和分光光度法測其抗菌活性和過氧化物酶活性，結果發現，兩種Tg-Hb對大腸桿菌和惡臭假單胞桿菌均有抗菌活性，Tg-HbⅡ對于惡臭假單胞菌和大腸桿菌的MIC值分別為0.063 mg／mL和0.13 mg／m L，Tg-HbⅠ對兩種菌的MIC均為0.048 mg／m L；兩種Tg-Hb均具有過氧化物酶活性，能催化愈創木酚、鄰苯二酚、對苯二酚、苯酚、左旋多巴等多種酚類物質。在Tg-Hb中添加GSH后，兩種Tg-Hb均不再對惡臭假單胞桿菌具有抗菌活性。可見，兩種Tg-Hb對惡臭假單胞桿菌等的抗菌活性均是通過其過氧化物酶活性發揮作用的。

泥蚶；血紅蛋白；抗菌活性；過氧化物酶活性

1 引言

血紅蛋白（hemoglobin，Hb）是生物界分布最廣的一類呼吸蛋白，主要在脊椎動物和部分無脊椎動物中存在［1］。近十多年的研究發現，Hb除了具有運輸和儲存氧氣的功能外，還具有調節p H值、控制體內一氧化氮水平、參與免疫反應、運輸硫化物、類卵黃蛋白原以及調節浮力等多種生物學功能［2—3］。盡管Hb是研究最多的一類呼吸蛋白，但以往的研究主要集中在其結構與攜氧功能方面。直到近幾年，受血藍蛋白抗菌活性研究的啟發，一些科學家才開始關注Hb的抗菌活性，Neajar-Arroume等［4—6］幾位科學家先后報道了脊椎動物Hb及其多肽片段的抗菌活性，關于無脊椎動物Hb的抗菌活性的研究就更少。

泥蚶Tegillarca granosa隸屬于軟體動物門瓣鰓綱，是一種具有重要經濟價值的海洋無脊椎動物，同時又是一類較特殊的含有Hb的雙殼貝類。因其沒有T細胞，缺乏真正意義上的抗體、沒有類似脊椎動物的特異性免疫系統，因而只能依靠血細胞及體液因子的先天免疫反應來抵御外界環境中病原微生物的入侵。因此，進行泥蚶血紅蛋白（Tg-Hb）的抗菌活性研究不僅有利于提高其自身的抗病能力，對于無脊椎動物免疫學的發展也具有重要的理論與實踐意義。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 實驗材料

泥蚶購自寧波市鄞州區東裕菜市場。金黃色葡萄球菌ATCC 29213、大腸桿菌ATCC35218、惡臭假單胞菌CGMCC1.0593、副溶血弧菌和哈維氏弧菌為浙江萬里學院微生物與環境工程重點實驗室提供。還原型谷胱甘肽（GSH）為Sigma公司產品，血紅蛋白濃度測定試劑盒為北京瑞爾達生物科技有限公司，其他試劑均為國產分析純。

2.1.2 主要儀器

AKTA蛋白層析系統（Explore100，GE公司），均質機（SH-2A，IKA公司），紫外分光光度計（3300 pro，美國Amershaw），二維納升級超高效液相質譜串聯儀（Nano Acquity UPLC／Synapt G2 MS，Waters）凝膠排阻色譜柱Sephacryl S-100 HR（HiPrep26／60，GE公司），CM-Sepharose Fast Flow（GE公司），立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-100SⅡ，上海迅博實業有限公司），恒溫培養箱（DHP-9162，上海慧泰儀器制造有限公司）。

2.2 泥蚶血紅蛋白的分離純化

將新鮮的泥蚶洗凈后，在潔凈的海水中吐沙4 h。撬開貝殼后，采集血液，置于含有檸檬酸抗凝劑的離心管中，2 000 r／min離心10 min，得血細胞。用0.9%NaCl溶液多次洗滌至上層溶液無色透明，用PBS緩沖液懸浮，勻漿破碎，以12 000 r／min的轉速4℃離心30 min，上清為泥蚶血紅蛋白粗品。

將上述的血紅蛋白粗品上Sephacryl S-100 HR凝膠層析柱，用PBS緩沖液以0.3 m L／min的流速洗脫，以2 mL／管收集洗脫液，用280 nm和415 nm兩種波長檢測洗脫液。

2.3 泥蚶血紅蛋白濃度測定

采用血紅蛋白測定試劑盒測定。測濃度分別為0、25、50、75、100 g Hb／L的氰化高鐵血紅蛋白標準液540 nm波長處的吸光度（A），以A為橫坐標Hb濃度為縱坐標做標準曲線，求斜率K值，

取5μL樣品液加入含1 mL B1溶液的比色皿中，混勻用B1做空白，在595 nm下測吸光度（C），

2.4 Tricine-SDS-PAGE

Tricine-SDS-PAGE參照文獻［7］進行，其中濃縮膠聚丙烯酰胺濃度為4%，分離膠濃度為16%。電泳結束后，以考馬斯亮藍染色。

2.5 瓊脂擴散法測抑菌活性

將對數生長期的細菌，用無菌生理鹽水配制成105cfu／m L的菌懸液，取200μL均勻涂布在制好的培養基上，放置牛津杯后依次加入200μL生理鹽水、HbⅠ（1.5 mg／mL）和HbⅡ（2 mg／m L）。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和惡臭假單孢桿菌置37℃生化箱培養24 h，哈維式弧菌和副溶血弧菌則置28℃生化箱培養24 h，取出觀察拍照。

2.6 最低抑菌濃度（MIC）測定

采用微量肉湯稀釋法。將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加Tg-Hb，每孔100μL，第12孔不加藥作為生長對照。將濃度相當于0.5麥氏比濁標準的菌懸液，經MH肉湯1∶1 000稀釋后，向每孔中加20μL，密封后置35℃普通空氣孵箱中，孵育16～20 h判斷結果。

2.7 過氧化物酶活性測定

取1 mL 50 mmol／L磷酸鹽緩沖液（4 mmol／L愈創木酚2 mmol／L H2O2）于一次性比色皿中，加入血紅蛋白，在25℃470 nm波長處，用動力學模式，測其30 s內的A470的變化。

2.8 米氏常數的測定

分別用鄰苯二酚、對苯二酚、苯酚、3-羥基-L-酪氨酸（L-DOPA）L-酪氨酸和對甲酚等代替愈創木酚反應，在25℃測其30 s內的A470的變化。以1／ΔA為縱坐標，以1／［S］橫坐標做雙倒數圖，求各酚類物質的米氏常數。

2.9 泥蚶血紅蛋白的質譜鑒定

將收集的峰2、峰3樣品，胰蛋白酶消化后用二維納升級超高效液相質譜串聯儀分析。將得到的數據用Mascot檢索引擎在Swiss Prot數據庫中進行檢索鑒定。

3 結果與分析

3.1 泥蚶血紅蛋白的分離純化

血紅蛋白粗品經凝膠層析后，洗脫圖譜見圖1。根據280 nm和415 nm（Tg-Hb在415 nm處有特征性的高吸光度）兩種波長下的檢測圖譜，可初步判斷峰1主要為雜蛋白，峰2、峰3為Tg-Hb的洗脫峰。已有文獻報道［8］，貝類血紅蛋白含有同源二聚體（HbⅠ）和異源四聚體（HbⅡ）兩種形式，其同源二聚體含有兩個相同或相似的亞基，每個亞基的分子質量約為15～16 kD；而異源四聚體則具有α2β2結構，分子質量約為60～70 k D。可見，峰2為泥蚶血紅蛋白Ⅱ（Tg-HbⅡ），峰3為泥蚶血紅蛋白Ⅰ（Tg-HbⅠ）。Tricine-SDS-PAGE結果顯示，峰1成分非常復雜，含多種大分子量的蛋白條帶，峰2樣品有兩個蛋白條帶，峰3樣品為單一條帶。Tricine-SDSPAGE中，峰2、峰3樣品均未出現雜蛋白條帶，說明均達到了較高的純度（圖2），由于分離過程簡單，Tg-Hb的回收率比較高，達74.3%（表1）。

圖1 泥蚶血紅蛋白的凝膠層析圖Fig.1 Gel chromatography of Tg-Hb

圖2 洗脫峰的Tricine-SDS-PAGE 1為峰1；2為峰2；3為峰3；M為低分子量標準蛋白Fig.2 Tricine-SDS-PAGE analysis of elution peak Lanes 1 to 3 indicate samples of peak 1，peak 2 and peak 3，M indicate marker

表1 泥蚶血紅蛋白的回收率Tab.1 Recovery of Tg-Hb from the blood of Tegillarca granosa

3.2 泥蚶血紅蛋白的質譜鑒定

為了進一步確定峰2、峰3組分是泥蚶血紅蛋白，對其進行了質譜鑒定（圖3、4）。結果顯示，峰2的一條鏈與不等殼毛蚶Scapharca inaequivalvisHbⅡ-A最相似；一條鏈與梯形毛蚶Anadara trapezia血紅蛋白的β鏈最相似；峰3與不等殼毛蚶的HbⅠ（同源二聚體）最相似。最終，峰2鑒定為Tg-HbⅡ（異源四聚體），峰3鑒定為Tg-HbⅠ（同源二聚體），與3.1中的推斷一致。

圖3 凝膠層析峰2的質譜圖Fig.3 MSspectrum for peak 2 of gel chromatography

圖4 凝膠層析峰3的質譜圖Fig.4 MSspectrum for peak 3 of gel chromatography

3.3 泥蚶血紅蛋白的抗菌活性

瓊脂擴散法檢測了Tg-Hb對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、惡臭假單胞菌、副溶血弧菌和哈維氏弧菌等菌的抗菌活性。結果表明，兩種Tg-Hb對大腸桿菌、惡臭假單胞菌這兩種革蘭氏陰性菌均有抗菌效果，有明顯的抑菌圈，而未檢測到Tg-Hb對其他幾種菌的抑菌圈（見表2），可見兩種Tg-Hb的抗菌活性都有選擇性。Tg-HbⅡ對大腸桿菌和惡臭假單胞菌的MIC分別為0.13 mg／mL和0.063 mg／mL（見表3），Tg-HbⅠ對兩種菌的MIC均為0.048 mg／mL（見表4）。

表2 泥蚶血紅蛋白對6種菌的抗菌活性Tab.2 Antimicrobial activities of Tg-Hb against bacteria

表3 不同濃度Tg-HbⅠ的抗菌效果Tab.3 Antibacterial activities of Tg-HbⅠat different concentration

表4 不同濃度Tg-HbⅡ的抗菌效果Tab.4 Antibacterial activities of Tg-HbⅡat different concentration

3.4 泥蚶血紅蛋白的抗菌機制

酶活性研究結果表明，兩種Tg-Hb均具有過氧化物酶活性（見圖5），能催化多種酚類物質（見表5）。一般認為，過氧化物酶可催化酚類物質生成醌及其后續一系列的產物，在此過程中產生活性氧（ROS），從而起到抗菌作用。本研究證實了這一點，在添加40 mmol／ L還原型谷胱甘肽（GSH，活性氧清除劑）的實驗組，Tg-Hb的抗菌能力喪失（見圖6）。因此判斷，Tg-Hb的抗菌活性與其過氧化物酶活性相關，通過過氧化物酶活性產生的活性氧發揮抗菌作用，當產生的ROS被GSH清除后，便不能發揮抗菌作用。但為什么Tg-Hb的抗菌作用有選擇性，這需要進一步深入研究。

圖5 Tg-Hb的過氧化物酶活性Fig.5 Peroxidase activity of Tg-Hb

表5 Tg-Hb的底物特異性Tab.5 Substrate specificity of Tg-Hb

圖6 GSH對泥蚶血紅蛋白抗菌活性的影響Fig.6 Effect of GSH on the antibacterial activity of Tg-Hb

4 討論

4.1 泥蚶血紅蛋白的分離純化

開展Tg-Hb免疫學研究的前提是得到純化的Tg-Hb，但直到目前為止，仍未見到有關Tg-Hb高效分離純化的研究報道。本實驗室在既往的研究中，已經克隆到Tg-Hb 3個亞基的基因Tg-HbⅠ、Tg-HbⅡA和Tg-HbⅡB［9］，并用軟件預測其分子量分別為16.04 k Da、16.23 kDa和17.23 k Da，等電點分別為9.144、8.836和5.745，因此進一步推斷Tg-HbⅠ、Tg-HbⅡ的分子量分別約為32 kDa和67 k Da，等電點可能分別在9和7.3附近。根據兩種Tg-Hb等電點和分子量的差異，選擇了陽離子交換層析和凝膠層析兩種層析技術。結果發現，陽離子交換層析并不適合Tg-Hb的純化。在上樣緩沖液p H6.0條件下，陽離子交換層析僅能吸附Tg-HbⅠ，不吸附Tg-HbⅡ，因此不能實現兩種Tg-Hb的同時純化。此外，在研究過程中發現Tg-Hb在偏離p H7.2的環境下易解聚，在p H6.0的條件下過夜就有一部分Tg-HbⅠ解聚成單體，因此采用進一步降低上樣緩沖液p H的方法更不可行。凝膠層析技術能實現兩種高純度Tg-Hb的同時分離，回收率高達74.3%（見圖1～3），而且凝膠層析采用的是p H7.2的PBS緩沖液，兩種Tg-Hb在p H7.2的PBS緩沖液中穩定性都較好。此外，本研究采用280 nm和415 nm雙波長檢測洗脫峰，實現了Tg-Hb峰方便快速判斷，為其他物種血紅蛋白的分離純化提供了參考。

4.2 泥蚶血紅蛋白的抗菌活性

近些年，呼吸蛋白的抗菌作用已成為國內外研究的熱點，已有多位科學家證實了部分呼吸蛋白的抗菌作用。Fang等［5—6］發現人血紅蛋白對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等細菌的抗菌作用；荊昭［3］發現毛蚶Scapharca kagoshimensis血紅蛋白對枯草桿菌和四聯球菌等菌具有抗菌作用；Jiang等［6］的研究表明鱟血藍蛋白就具有抗金黃色葡萄球菌等菌的作用；Deloffre等［10］發現沙蠶Nereis diversicolor血紫蛋白也具有抗細菌活性。本研究則證實Tg-Hb對大腸桿菌和惡臭芽孢桿菌等部分革蘭氏陰性菌的抗菌作用。

呼吸蛋白的酶活性方面，關于血藍蛋白的酚氧化酶活性的報道較多。多位科學家［11—15］已證明血藍蛋白能被SDS、胰蛋白酶和入侵微生物等因子激活，具有酚氧化物酶活性，產生ROS，發揮抗菌作用。血藍蛋白為什么具有酚氧化酶活性，一些科學家從結構方面找到了答案。血藍蛋白與酚氧化物酶同屬于Ⅲ型銅蛋白，都具有兩個銅離子，在活性位點的基因序列與蛋白質結構均具有高度的相似性［16］。Hb雖然是研究最廣泛和深入的呼吸蛋白，但長期以來，關于Hb結構與功能關系的研究都集中在它如何與O2結合、分離和運輸O2等方面，Hb的類酶催化活性方面研究不多。2002年，Kawano等［17］發現人血紅蛋白的過氧化物酶活性，但其后大家的目光均集中在人血紅蛋白的過氧化物酶活性對機體的傷害［18］及作為過氧化物酶替代品的可行性研究方面［19—20］，并沒有意識到Hb具有抗菌活性，更沒有意識到Hb可利用其過氧化物酶活性發揮抗菌作用。受血藍蛋白抗菌及酚氧化酶研究的啟發，一些科學家也開始關注Hb的抗菌作用及其與過氧化物酶活性的關系。Fang［5］的研究表明，當有細菌侵入機體時人血紅細胞內的血紅蛋白會釋放出ROS，迅速殺死致病微生物。Jiang等［6］研究得出人血紅蛋白在入侵病菌毒力因子的刺激下獲得了一種過氧化物酶的活性，催化產生ROS，進而產生有毒衍生物，起到殺菌作用。

本研究進一步證實了Tg-Hb對大腸桿菌和惡臭芽孢桿菌等部分革蘭氏陰性菌也有抗菌作用，也檢測到了其過氧化物酶活性，并且證明Tg-Hb的抗菌活性與其過氧化物酶活性有關（見圖5、6）。此外，Tg-Hb的抗菌作用具有選擇性，如對金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌等菌并沒有抗菌作用，這又說明其本身的過氧化物酶活性可能偏低，不足以抗菌。分析其抗菌機理，很可能是敏感菌分泌物或組分進一步激活了它的過氧化物酶活性，產生了大量的ROS，從而發揮抗菌作用。這些發現，為進一步闡明Hb的抗菌機制提供了新的思路。

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Purification and antibacterial activity of hemoglobin from Tegillarca granosa

Wang Sufang1，2，Bao Yongbo2，Shi Miaojiang2，Zheng Danni2，Yang Tingting1，2，Lin Zhihua2

（1.School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China；2.Zhejiang Key Laboratory of Aquatic Germplasm Resources，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China）

Two kinds of hemoglobins were purified by gel chromatography with a recovery 74.3%.They were identified as Tg-HbⅠ（homodimer）and Tg-HbⅡ（heterogeneous tetramer）by Tricine-SDS-PAGE and mass spectrometer.The agar diffusion method and spectrophotometric method were used to detect their antibacterial activity and peroxidase activity，respectively.Results showed that both hemoglobins exhibited antibacterial activities againstEschetichia coliandPseudomonas putida.The MIC values of Tg-HbⅡtowardsE.coliandP.putidawere 0.063 mg／mL and 0.13 mg／m L，while corresponding data of Tg-HbⅠwere 0.048 mg／m L.Both hemoglobins showed peroxidase activities，which could catalyze various of phenolic substances，such as guaiacol，pyrocatechol，hydroquinone，phenol，L-DOPA，etc.Both hemoglobins lost their antibacterial activities againstP.putidain the presence of GSH，indicating that they played the antibacterial abilities through their peroxidase activities.

Tegillarca granosa；hemoglobin；antibacterial activity；peroxidase activity

S944.4+4

A

0253-4193（2014）12-0067-07

王素芳，包永波，施淼江，等.泥蚶血紅蛋白的制備及其抗菌活性研究［J］.海洋學報，2014，36（12）：67—73，

10.3969／j.issn. 0253-4193.2014.12.006

Wang Sufang，Bao Yongbo，Shi Miaojiang，et al.Purification and antibacterial activity of hemoglobin fromTegillarca granosa［J］.Acta Oceanologica Sinica（in Chinese），2014，36（12）：67—73，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2014.12.006

2014-01-15；

2014-03-27。

國家863計劃項目（2012AA10A410）；寧波市自然基金項目（2013A610161）；浙江省教育廳高校科研項目（Y201225951）；國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201310876018）；寧波市海洋貝類科技創新團隊（2011B82017）；水產科學浙江省重中之重學科開放基金項目。

王素芳（1977—），女，山東省單縣人，博士，主要研究水產資源的開發與利用。E-mail：24274414＠qq.com

*通信作者：包永波，主要從事貝類功能基因和蛋白組研究。E-mail：bobbao2001＠gmail.com