藍(lán)莓米酒中總花色苷含量的測定

張采　沈曉同

摘 要：采用消光系數(shù)和pH示差2種方法對自制藍(lán)莓米酒中總花色苷含量進(jìn)行測定，測定值分別為16.82（±0.36）mg/100mL和17.48（±0.40）mg/100mL。2種方法均較為準(zhǔn)確地反映了樣品在溶液體系中的濃度，消光系數(shù)法所測值略小于pH示差法，后者操作難度比前者大。建議相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)時可選用較為簡便的消光系數(shù)法，最終產(chǎn)品選用較為準(zhǔn)確的pH示差法。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓米酒；花色苷；pH示差法；消光系數(shù)法

中圖分類號 TS26 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）08-163-03

Abstract：Total anthocyanin content in blueberry rice wine was determined by the extinction coefficient and pH-differential methods，measured values ??were 16.82（±0.36）mg/100mL and 17.48（±0.40）mg/100mL. Both methods were more accurate reflection of the sample concentration in the solution of the system. The content tested by extinction coefficient was slightly smaller than the pH-differential method，the latter operation was more difficult than the former. We suggested product development time can be used extinction coefficient method，it was more simple，and the final product selected pH-differential method，it was more accurate.

Key words：Blueberry rice wine；Anthocyanin；pH-differential method；Extinction coefficient method

藍(lán)莓（blueberry）屬杜鵑花科越橘屬的一種，多年生落葉或常綠灌木。其果實為漿果，呈深藍(lán)色，披白霜，近圓形，皮薄籽小，具有極高的營養(yǎng)價值[1]。藍(lán)莓果實中花青素含量極高，花青素與糖以糖苷鍵結(jié)合形成花色苷（Anthocyanin），花色苷是以黃酮核為基礎(chǔ)的一類物質(zhì)中能呈現(xiàn)紅色的一族化合物[2]。近30a間，關(guān)于藍(lán)莓花色苷具有的抗氧化作用及其他生物活性的研究報道急劇攀升[3-5]，新開發(fā)的產(chǎn)品如雨后春筍般涌現(xiàn)出來，但大多未明確標(biāo)出功效成分花色苷的含量，消費者在選購時缺乏參考依據(jù)。

總花色苷的定量方法主要是根據(jù)其光學(xué)特性進(jìn)行分析，包括分光光度法中的色價法、pH示差法、消光系數(shù)法[6-7]，另外還有高效液相色譜法等。高效液相色譜法定量測定花色苷含量精確度雖高，但設(shè)備儀器較昂貴，需要標(biāo)準(zhǔn)品，且花色苷標(biāo)準(zhǔn)品很不穩(wěn)定，從而限制了這種方法的廣泛使用；色價法是花色苷的百分比值，不能準(zhǔn)確表示溶液的濃度含量。本研究旨在比較pH示差法和消光系數(shù)法測定自主研發(fā)的藍(lán)莓米酒產(chǎn)品總花色苷的差異，從而為其他產(chǎn)品花色苷的測定提供參考。

1 儀器與試劑

UV-1801紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器有限公司；PHS-3C pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LD4-2A型低速離心機(jī)：北京雷勃爾有限公司；EL204電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；95%乙醇、氯化鉀、醋酸、醋酸鈉、鹽酸均為分析純。藍(lán)莓米酒由蘇州市職業(yè)大學(xué)發(fā)酵食品實驗室自釀。

2 方法

2.1 藍(lán)莓米酒發(fā)酵工藝

2.2 試劑配制 1.86g/L的鹽酸-氯化鉀緩沖液（pH=1.0）；54.43g/L的鹽酸-醋酸鈉緩沖液（pH=4.5）；酸化乙醇（95%乙醇-1.5mol/L鹽酸體積比85∶15）。

2.3 樣品制備 移取適量10mL藍(lán)莓米酒原液用酸化乙醇定容至50mL，室溫靜置過夜后4 000r/min離心10min，過濾，取上清液備用。

2.4 花色苷含量測定

2.4.1 消光系數(shù)法[8] 取待測液5mL放入比色管中，用酸化乙醇稀釋至25mL，使其比色測定時吸光度值在0.2～0.7。由于花色苷在紫外波長下的吸收易混淆于其它類黃酮類化合物，故紫外分光光度計在400～800nm波長范圍內(nèi)掃描，以蒸餾水為參比，在其最大吸收波長處測定待測液的吸光度?；ㄉ蘸坑嬎愎饺缦拢?/p>

A=Amax （1）

C（mg/100mL）=[（A×V1）/（98.2×V2）]×100 （2）

式中，Amax：最大吸收波長處的吸光度值；V1：定容體積（mL）×稀釋倍數(shù)；V2：樣品體積（mL）；98.2：花色苷平均消光系數(shù)。

同一樣品平行測定6次，計算出花色苷含量，精密度用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來表示。

2.4.2 pH示差法[7，9] 各取2.5mL待測液放入2只比色管中，分別用pH1.0的鹽酸-氯化鉀緩沖液和pH4.5的鹽酸-醋酸鈉緩沖液定容至10mL，避光陰涼處平衡90min。

平衡好的試樣上紫外分光光度計檢測，用蒸餾水作對照，紫外分光光度計在400～800nm波長范圍內(nèi)掃描，分別測定藍(lán)莓米酒花色苷在pH1.0和pH4.5緩沖液中的最大吸收波長和最大吸收波長處的吸光度值。

根據(jù)FULEKI T的研究，結(jié)合比耳定律，花色苷含量的計算公式：endprint

A=（Amax-A700）pH1.0-（Amax-A700）pH4.5 （3）

C（mg/100mL）=[（A×MW）/（ε×I）]×DF×100 （4）

式中，Amax：最大吸收波長處的吸光度值；C：樣品中花色苷含量（mg/100mL）；MW：矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子量（449.2mg/mol）；DF：總稀釋倍數(shù)；ε：矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)（26 900L/mol?cm）；I：比色杯光程（cm）。

同一樣品平行測定6次，計算出花色苷含量。精密度計算同2.4.1。

3 結(jié)果與分析

3.1 消光系數(shù)法

3.1.1 最大吸收波長的確定 從圖1可知，直接用酸化乙醇稀釋的藍(lán)莓米酒花色苷溶液中，在546nm處有一最大吸收峰，這是花色苷的特征峰。

3.1.2 精密度試驗 表1顯示，在酸化乙醇溶液中，通過對花色苷吸光度值的6次平行測定，計算得出藍(lán)莓米酒原液中花色苷含量為16.82（±0.36）mg/100mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.22%。

3.2 pH示差法

3.2.1 最大吸收波長的確定 比較圖2、圖3可知，在pH1.0的鹽酸-氯化鉀緩沖液中，藍(lán)莓米酒在526nm左右處有一最大吸收峰。該吸收峰在pH1.0的鹽酸-氯化鉀緩沖液和pH4.5的鹽酸-醋酸鈉緩沖液中差值最大。考慮到儀器的波動，確定在最大吸收值526nm和700nm處讀數(shù)。

3.2.2 精密度試驗 從表2可知，在所選定的pH值分別為1.0和4.5的緩沖液中，通過對花色苷吸光度值的6次平行測定，計算得到藍(lán)莓米酒原液中花色苷含量為17.48（±0.40）mg/100mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.41%。

4 結(jié)論

采用消光系數(shù)法和pH示差法測定自制藍(lán)莓米酒總花色苷含量，分別為16.82（±0.36）mg/100mL和17.48（±0.40）mg/100mL。2種方法均較為準(zhǔn)確地反映了樣品在溶液體系中的濃度，但pH示差法操作難度明顯大于消光系數(shù)法，因此建議相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)時可選用較為簡便的消光系數(shù)法，最終產(chǎn)品選用較為準(zhǔn)確的pH示差法。

參考文獻(xiàn)

[1]錢慧碧，辛秀蘭，張東升，等.溶劑提取藍(lán)莓果渣中總黃酮的研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31（11）：272-274.

[2]宋德群，孟憲軍，王晨陽，等.藍(lán)莓花色苷的pH 示差法測定[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，43（2）：231-233.

[3]魏國華，呂良偉，邵斌，等.越橘提取物的研究進(jìn)展[J].中國食品添加劑，2011（4）：139-143.

[4]陳介甫，李亞東，徐哲.藍(lán)莓的主要化學(xué)成分及生物活性[J].藥學(xué)學(xué)報，2010，45（4）：422?429.

[5]李穎暢，孟憲軍，孫靖靖，等.藍(lán)莓花色苷的降血脂和抗氧化作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008（10）：44-48.

[6]曹少謙，潘思軼.血橙花色苷研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2006，09（27）：278-282.

[7]孫婧超，劉玉田，趙玉平，等.pH示差法測定藍(lán)莓酒中花色苷條件的優(yōu)化[J].中國釀造，2011（11）：171-174.

[8]閆亞美，冉林武，曹有龍，等.黑果枸杞花色苷含量測定方法研究[J].食品工業(yè)，2012，33（6）：145-147.

[9]王秀菊.藍(lán)莓干酒及藍(lán)莓酒渣花色苷提取工藝的研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010. （責(zé)編：施婷婷）endprint

A=（Amax-A700）pH1.0-（Amax-A700）pH4.5 （3）

C（mg/100mL）=[（A×MW）/（ε×I）]×DF×100 （4）

式中，Amax：最大吸收波長處的吸光度值；C：樣品中花色苷含量（mg/100mL）；MW：矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子量（449.2mg/mol）；DF：總稀釋倍數(shù)；ε：矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)（26 900L/mol?cm）；I：比色杯光程（cm）。

同一樣品平行測定6次，計算出花色苷含量。精密度計算同2.4.1。

3 結(jié)果與分析

3.1 消光系數(shù)法

3.1.1 最大吸收波長的確定 從圖1可知，直接用酸化乙醇稀釋的藍(lán)莓米酒花色苷溶液中，在546nm處有一最大吸收峰，這是花色苷的特征峰。

3.1.2 精密度試驗 表1顯示，在酸化乙醇溶液中，通過對花色苷吸光度值的6次平行測定，計算得出藍(lán)莓米酒原液中花色苷含量為16.82（±0.36）mg/100mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.22%。

3.2 pH示差法

3.2.1 最大吸收波長的確定 比較圖2、圖3可知，在pH1.0的鹽酸-氯化鉀緩沖液中，藍(lán)莓米酒在526nm左右處有一最大吸收峰。該吸收峰在pH1.0的鹽酸-氯化鉀緩沖液和pH4.5的鹽酸-醋酸鈉緩沖液中差值最大?？紤]到儀器的波動，確定在最大吸收值526nm和700nm處讀數(shù)。

3.2.2 精密度試驗 從表2可知，在所選定的pH值分別為1.0和4.5的緩沖液中，通過對花色苷吸光度值的6次平行測定，計算得到藍(lán)莓米酒原液中花色苷含量為17.48（±0.40）mg/100mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.41%。

4 結(jié)論

采用消光系數(shù)法和pH示差法測定自制藍(lán)莓米酒總花色苷含量，分別為16.82（±0.36）mg/100mL和17.48（±0.40）mg/100mL。2種方法均較為準(zhǔn)確地反映了樣品在溶液體系中的濃度，但pH示差法操作難度明顯大于消光系數(shù)法，因此建議相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)時可選用較為簡便的消光系數(shù)法，最終產(chǎn)品選用較為準(zhǔn)確的pH示差法。

參考文獻(xiàn)

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[2]宋德群，孟憲軍，王晨陽，等.藍(lán)莓花色苷的pH 示差法測定[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，43（2）：231-233.

[3]魏國華，呂良偉，邵斌，等.越橘提取物的研究進(jìn)展[J].中國食品添加劑，2011（4）：139-143.

[4]陳介甫，李亞東，徐哲.藍(lán)莓的主要化學(xué)成分及生物活性[J].藥學(xué)學(xué)報，2010，45（4）：422?429.

[5]李穎暢，孟憲軍，孫靖靖，等.藍(lán)莓花色苷的降血脂和抗氧化作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008（10）：44-48.

[6]曹少謙，潘思軼.血橙花色苷研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2006，09（27）：278-282.

[7]孫婧超，劉玉田，趙玉平，等.pH示差法測定藍(lán)莓酒中花色苷條件的優(yōu)化[J].中國釀造，2011（11）：171-174.

[8]閆亞美，冉林武，曹有龍，等.黑果枸杞花色苷含量測定方法研究[J].食品工業(yè)，2012，33（6）：145-147.

[9]王秀菊.藍(lán)莓干酒及藍(lán)莓酒渣花色苷提取工藝的研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010. （責(zé)編：施婷婷）endprint

A=（Amax-A700）pH1.0-（Amax-A700）pH4.5 （3）

C（mg/100mL）=[（A×MW）/（ε×I）]×DF×100 （4）

式中，Amax：最大吸收波長處的吸光度值；C：樣品中花色苷含量（mg/100mL）；MW：矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子量（449.2mg/mol）；DF：總稀釋倍數(shù)；ε：矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)（26 900L/mol?cm）；I：比色杯光程（cm）。

同一樣品平行測定6次，計算出花色苷含量。精密度計算同2.4.1。

3 結(jié)果與分析

3.1 消光系數(shù)法

3.1.1 最大吸收波長的確定 從圖1可知，直接用酸化乙醇稀釋的藍(lán)莓米酒花色苷溶液中，在546nm處有一最大吸收峰，這是花色苷的特征峰。

3.1.2 精密度試驗 表1顯示，在酸化乙醇溶液中，通過對花色苷吸光度值的6次平行測定，計算得出藍(lán)莓米酒原液中花色苷含量為16.82（±0.36）mg/100mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.22%。

3.2 pH示差法

3.2.1 最大吸收波長的確定 比較圖2、圖3可知，在pH1.0的鹽酸-氯化鉀緩沖液中，藍(lán)莓米酒在526nm左右處有一最大吸收峰。該吸收峰在pH1.0的鹽酸-氯化鉀緩沖液和pH4.5的鹽酸-醋酸鈉緩沖液中差值最大。考慮到儀器的波動，確定在最大吸收值526nm和700nm處讀數(shù)。

3.2.2 精密度試驗 從表2可知，在所選定的pH值分別為1.0和4.5的緩沖液中，通過對花色苷吸光度值的6次平行測定，計算得到藍(lán)莓米酒原液中花色苷含量為17.48（±0.40）mg/100mL，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.41%。

4 結(jié)論

采用消光系數(shù)法和pH示差法測定自制藍(lán)莓米酒總花色苷含量，分別為16.82（±0.36）mg/100mL和17.48（±0.40）mg/100mL。2種方法均較為準(zhǔn)確地反映了樣品在溶液體系中的濃度，但pH示差法操作難度明顯大于消光系數(shù)法，因此建議相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)時可選用較為簡便的消光系數(shù)法，最終產(chǎn)品選用較為準(zhǔn)確的pH示差法。

參考文獻(xiàn)

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[4]陳介甫，李亞東，徐哲.藍(lán)莓的主要化學(xué)成分及生物活性[J].藥學(xué)學(xué)報，2010，45（4）：422?429.

[5]李穎暢，孟憲軍，孫靖靖，等.藍(lán)莓花色苷的降血脂和抗氧化作用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008（10）：44-48.

[6]曹少謙，潘思軼.血橙花色苷研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2006，09（27）：278-282.

[7]孫婧超，劉玉田，趙玉平，等.pH示差法測定藍(lán)莓酒中花色苷條件的優(yōu)化[J].中國釀造，2011（11）：171-174.

[8]閆亞美，冉林武，曹有龍，等.黑果枸杞花色苷含量測定方法研究[J].食品工業(yè)，2012，33（6）：145-147.

[9]王秀菊.藍(lán)莓干酒及藍(lán)莓酒渣花色苷提取工藝的研究[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010. （責(zé)編：施婷婷）endprint