微生物學大實驗模塊“天然酵母菌的篩選、擴大培養和鑒定”的教改研究與實踐

梁寶東　魏海香　朱九濱等

摘要 以“天然酵母菌的篩選、培養和選育”為主線，設計了一個由4個相互關聯、前后銜接一體的實驗組成的綜合性研究型實驗模塊，進行教學實踐與改革。實驗模塊主要包括：培養基的配制、分裝與滅菌，酵母菌的分離與純化，酵母的擴大培養，菌種的鑒定。強化實踐，提高學生對于知識的綜合應用能力。

關鍵詞 微生物學實驗；天然酵母菌；實驗模塊

中圖分類號 S-01 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）05-01581-02

Abstract A group of related experiments， focusing on isolation， cultivation and identification of natural yeast into an experiment module， was designed and applied in microbiological experiment teaching. The experiment module included preparation and sterilization of media， isolation of the strain， enlarge cultivation conditions and identification of the strain. The teaching method can strengthen the practice ability and improve the students` ability of comprehensive application of knowledge.

Key words Microbiological experiment； Natural yeast； Experiment module

微生物學是生物工程專業重要的一門核心專業課程，實驗課是理論課程的重要組成部分，具有很強的實踐性和應用性[1]。現使用教材中，往往都是獨立實驗，且實驗之間缺乏相應的關聯性，導致學生對實驗課程沒有系統的認識。尤其是新建的地方本科院校，受先前教學方式的影響和學生知識儲備的限制，往往只是掌握一些零星分散的實驗技術，如何在具體的教學過程中提高學生對有關知識技術的整合，有針對性地解決實際生產和科研問題，顯得尤為必要。另外，受傳統教學方式的影響，學生經常被動地去接受和模仿，缺乏主動性和獨立思考。針對這些問題，可在學生掌握基本實驗技能的基礎上，在微生物學實驗課程中嘗試性地開設綜合性大實驗，結合學院設立的“大學生創新性學習和研究項目”，以課題驅動構建教學內容，提高學生綜合應用和解決實際問題的能力。筆者以“天然酵母菌的篩選、培養和選育”為主線的實驗模塊為主，介紹濟寧學院微生物學實驗課程的教改研究。該實驗模塊以研究型課題為標準，設計4次實驗課，按照相互關聯、前后銜接的思路， 共同組成一個研究型實驗， 代替了原微生物學實驗課程幾個分散的、獨立的實驗，使微生物學基礎實驗與技術實驗有機地組合起來， 具體介紹如下。

1 第1次實驗：培養基的配制、分裝與滅菌（3學時）

安排學生配制實驗所需的全部培養基，包括固體培養基、液體培養基，并進行分裝（表1），準備培養皿、移液管等，分別進行高壓蒸汽滅菌和烘箱干熱滅菌。由于配制培養基種類較多，可兩個同學為一組，分工配制不同的培養基，然后進行交流。這次實驗課的安排與以往不同的是，將單純的培養基配制和滅菌技術安排為一系列實驗，這樣就大大提高了實驗的針對性和目的性，豐富了培養基的配制種類，使同學們更深刻地認識到培養基在微生物實驗中的重要性，實驗的積極性和主動性大大增強。如酵母菌富集培養基含有較高的葡萄糖和較酸的環境，以及能抑制多種雜菌（許多細菌、放線菌和快速生長的霉菌）的孟加拉紅，故十分有利于酵母菌的增殖，加強了對微生物培養的認知。

2 第2次實驗：酵母菌的分離與純化（3學時）

學生于課前到校園附近葡萄糖園采集土壤樣本， 不同組學生分別選擇葡萄糖園表土（鏟去2～3 cm的表土，再采集土樣）、有落果的表土、葡萄糖爛果、新鮮的葡萄糖粒、結果處的葡萄糖梗，帶回實驗室，投入裝有20 ml酵母菌富集培養液的三角瓶中，置于28 ℃恒溫搖床震蕩培養2～3 d。用平板劃線法、涂布平板法或傾注平板法分離單菌落。若菌株不純，可對菌落進行多次劃線分離，以獲得純菌落。將上述純種接種至麥芽汁試管斜面上，經28 ℃培養1～2 d后，在顯微鏡下觀察其形態，結合菌落形態，判斷是否為目的菌株。將得到的菌落純的菌種貼上標簽，放4 ℃下保存，備用[2]。該實驗將以往的單純土壤微生物的分離純化實驗進行了具體化，變為酵母菌的分離純化，稀釋澆注平板、稀釋涂布平板和平板劃線分離、斜面菌種轉接、液體培養等實驗技術全部安排在這個實驗中，使同學們不但掌握了具體的實驗技術，還了解到如何應用這些技術從自然界分離獲得所需要的目的菌株。

3 第3次實驗：酵母菌的擴大培養（6 學時）

安排學生先利用搖床進行培養， 100 ml三角瓶，12°Bx 麥芽汁培養基，裝液量 20 ml，接新活化的斜面菌種1～2環，30 ℃靜置培養24～36 h。細胞濃度達8.0×108個/ml以上，無雜菌，無死細胞，作為一級種子； 500 ml三角瓶，培養基同上，裝液量80 ml，每瓶接種一級種子液約8 ml，30 ℃培養12～16 h，細胞濃度達1.5×109個/ml以上，無雜菌，無死細胞，為二級種子。將二級種子接種于5L-全自動發酵罐，裝液量為4 L 12°Bx 麥芽汁培養基，30 ℃培養[3]。在培養的過程中，每2 h取樣，檢測發酵液中的還原糖含量、pH和酵母菌的細胞數，測量方法分別為3，5二硝基水楊酸法、數字pH計和血球計數板法。根據測量的數據，以培養時間為橫坐標，檢測參數為縱坐標，分別繪制降糖曲線、pH曲線和生長曲線，根據這些曲線判斷酵母菌生長的規律。這樣的安排將原來單一、枯燥的實驗轉變為綜合性的擴大培養發酵實驗，同時還讓同學們掌握了搖瓶液體培養、5L-全自動發酵罐的使用和培養、生長曲線的測定和發酵相關參數的測定等，緊密圍繞專業開設實驗。

4 第4次實驗：酵母菌的鑒定（3學時）

形態學特征：分別將待鑒定菌種接種于麥芽汁液體培養基和固體培養基，28 ℃培養3 d觀察，記錄細胞形態學和培養特征。用測微尺在顯微鏡下測定鑒定菌株個體的大小。將鑒定菌株接種于M cclary培養基上，28 ℃培養3 d，涂片在顯微鏡下觀察子囊孢子的形成。

生理生化特征：分別進行糖發酵實驗、碳源和氮源同化實驗、產類淀粉化合物和產酯測定實驗、牛奶凍化、無維生素培養基生長實驗、需維生素測定、耐滲透壓、尿素分解、明膠液化實驗、培養溫度實驗等。

菌種的培養過程盡可能都安排在課余時間，課堂上側重特征鑒定。鑒于此部分實驗多，依據前期菌種分離過程記錄的菌種特征，選擇較為典型的菌種進行鑒定，同時將2～3小組同學合并成1組，分別做相應的實驗，減少工作量，又完成鑒定工作。根據記錄鑒定菌株的形態學特征和生理生化特征，對照參考文獻[4]，確定菌株的門、綱、目、科、屬、種。

整個實驗過程要求學生客觀、真實記錄。實驗結束后，學生寫出一份完整的實驗報告，要求實驗報告按照研究型論文的寫作方式進行。隨后，每組同學分別將試驗內容做成PPT格式，擇優進行課堂講解（選擇1名學生）和討論，分析實驗中出現的各種問題，并對結果進行必要的歸納總結和理論探討，并將此部分內容進行整理歸納，附實驗報告后再統一上交[5]。

要開展好這類綜合型、研究型的實驗教學，總結出以下幾個問題：①學生需要利用較多的課外時間，就要求合理進行實驗計劃和時間分配，避免實驗與其他課程相沖突；②實驗空間的限制性，若多組同時進行，需占用較大實驗室空間和設備，要合理進行調節；③每組實驗周期較長，學生欠缺研究經驗，需要教師花費較多精力和時間，大大增加了工作量；④篩選菌種的偶然性可能會使部分組同學的實驗出現負結果，需進行組間人員調配或共享菌株進行后續分實驗；⑤實驗過程中，學生要及時總結問題，分析原因，組間交流經驗，團隊合作。在實驗結束后的討論過程中，同學反映真實體會到了科研工作的艱辛，認識到細致觀察、耐心的重要性。此類實驗開設方式得到大家的認可，增強了實驗的整體性、系統性和學生獨立自主研究的能力，增加了發散性思維，使學生初步學會研究型論文的寫作方法，并將學到的理論知識更好地應用于解決問題上，很好地鍛煉了實踐操作能力，不但為后續的畢業課題或研究工作打下堅實的基礎，還增強了學生在就業市場中的競爭力。

參考文獻

[1]周德慶.微生物學教程[M].北京：高等教育出版社，2011.

[2] 周德慶.微生物學實驗教程[M].北京：高等教育出版社，2010.

[3] 賈士儒.生物工程專業實驗[M].北京：中國輕工業出版社，2010.

[4] 巴尼特A，佩恩R W，亞羅D.酵母菌的特征與鑒定手冊[K].胡瑞卿，譯.青島：青島海洋出版社，1991：100-175.

[5] 毛露甜，王紹芬.微生物學實驗教學中開展設計性實驗的做法與體會[J].微生物學通報，2007，34（3）：614-616.