提高纖維素酶產生菌產酶能力方法的研究進展

田海嬌　吳昊　楊洪巖

摘要 纖維素酶能夠將纖維素分解為葡萄糖。該酶在解決當前世界面臨的能源、糧食、環境污染等危機方面具有重要意義。然而，迄今為止纖維素酶活和產率均較低、生產周期長、成本高，都嚴重地阻礙其工業化的應用。因此，如何提高纖維素產生菌產酶能力是近年來研究的熱點。結合國內外研究進展，從培養體系的優化（碳源、氮源、表面活性劑和未知生長因子）、培養條件的優化（溫度、pH、溶氧量）、菌種改造（化學誘變、物理誘變、物理化學復合誘變、基因工程法）等方面對優化菌種產酶能力的方法進行了分析與總結。目前，雖在培養條件優化和菌種分子改造方面初有成效，但還沒有一種方法能夠大幅提升酶活性。今后，應加強菌種選育和發酵工藝等基礎研究工作，分離和篩選出高效纖維素分解菌群，并用分子生物學手段進一步優化菌種，提高酶活。

關鍵詞 纖維素酶；微生物；培養體系；培養條件；菌種改造

中圖分類號 S182 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）05-01281-06

Abstract Cellulases can hydrolyze cellulose to glucose. It is important to solve the problem of energy shortage， food crisis and environmental pollution in the world. However， enzyme activity and production efficiency have been very low till now. Due to long production period and high cost， industrial application of cellulase is severely hampered. Therefore， how to improve the capacity of enzyme production has become a focus involved in cellulase production in recent years. In this study， advances in methods to improve cellulases were summarized. Optimization of culture system （carbon， nitrogen， surfactants and unknown growth factors）， optimization of culture conditions （temperature， pH and dissolved oxygen） and construction of microorganism （chemical mutation， physical mutation， combined physical and chemical mutagenesis and genetic engineering） were involved. Based on the current researches， no methods can effectively enhance the enzyme activity， although some progresses have been achieved in optimization of culture conditions and molecular transformation for strains. In the future， research on microbial selection and fermentation technique should be strengthened. Molecular biological method should be applied for further exploring the improvement of enzyme activity.

Key words Cellulase； Microorganism； Culture system； Cultivation conditions； Strain modification

隨著人口的增長、生活水平的提高和工業化進程的加速，全球的能源需求逐漸增加，由此產生的能源安全、石油消耗、全球變暖等問題促使世界各國加快了對替代能源的研究。纖維素乙醇的研究與開發已成為世界各國研發的熱點。纖維素（Cellulose）是由葡萄糖組成的大分子多糖，不溶于水及一般有機溶劑，是植物細胞壁的主要成分，是地球上最古老、最豐富的天然高分子，是取之不盡、用之不竭的人類最寶貴的天然可再生資源。欲利用纖維素，首先需要將纖維素進行降解。纖維素的降解包括物理法、化學法和生物法。生物降解以其條件溫和、耗能低和污染少等特點，成為目前新能源研究的方向之一。

纖維素的生物降解主要通過纖維素酶來實現。纖維素酶是使纖維素分解生成葡萄糖的一組酶的總稱，在輕工業如造紙、食品、飼料、環保等領域的應用正日益廣泛，潛力巨大。其最大的潛在用途是將纖維類物質酶法水解成葡萄糖，進一步發酵生成酒精等能源物質，造福人類。然而，迄今為止纖維素酶活和產率均較低，生產周期長，成本高。這些都嚴重阻礙其工業化的應用[1]。

自然界中微生物是纖維素酶的主要貢獻者。可以分泌纖維素酶的菌種包括細菌、放線菌和真菌，其中絲狀真菌是研究最多的纖維素降解類群。縱觀國內外的研究，發現纖維素高效分解菌的選育仍然是纖維素酶研究的重點之一。同時，利用合適的方法提高篩選的微生物菌株的產酶能力、穩定產酶特性是進一步研究的重點。相關的研究也將對解決目前能源危機、糧食短缺以及環境污染等一系列問題具有重要的意義[2]。該研究綜合目前國內外的研究成果，對提高纖維素酶活的方法進行總結，并且根據現狀提出進一步提高酶活方法的建議，以期為纖維素酶的生產提供技術指導。

1 培養體系的優化

1.1 碳源

纖維素酶是誘導酶。理想的碳源應該既能提供菌種生長所需能量，又能誘導纖維素酶基因的高效表達[3]。據報道，碳源對菌絲細胞合成纖維素酶的影響很大[4]。一般認為，碳源的性質和類型是決定酶產生成敗的關鍵之一。培養基的碳源一般為碳水化合物。碳源在酶制劑生產中的作用較復雜。除了供給微生物所需的能源外，它往往對產酶有誘導與阻遏作用。

碳源的種類有很多，研究主要側重能夠促使產酶量增加的纖維素類和糖類。季更生等[5]對綠色木霉的研究發現，當以5.0 g/L硫酸鹽紙漿為碳源，纖維素酶活值為27.96 IU/ml，其值是以纖維素為碳源時的2.19倍。Dashtban等[6]研究3種不同類型的Trichoderma reesei，分別為QM6a（野生型）、QM9414（突變體）和RUTC30，發現以微晶纖維素為碳源時均有較高的酶活性，并且突變體和RUTC30顯著大于野生型。Aftab 等[7]發現，利用更高濃度纖維素（50 g/L）和乳糖（150 g/L）的培養基可獲得更高的產酶量。Matkar等[8]分離出一株Aspergillus niger，也發現在菌種產酶補給碳源時，乳糖對纖維素酶的生產有誘導作用。還有一些其他碳源也被發現，例如Deswal等[9]新分離出一株褐腐菌，研究其產纖維素酶培養基條件的優化。在不同的碳源試驗中，發現以麥麩為碳源時產酶的酶活性最大。一些經預處理得到的碳源被證明更能激發菌種的產酶能力。Parka等[10]將milk pack（MP）與纖維素酶（3 FillterPaper Unit（FPA）/g MP）混合處理作為Acremonium cellulolyticus菌種的唯一碳源時，在3 L發酵罐培養，所得纖維素酶的活性為16 FPA/ml，相比未處理的純纖維素高出25倍。

目前，產纖維素酶的菌種培養基中的碳源主要有纖維素、乳糖、蔗糖、羧甲基纖維素（CMC）、葡萄糖。其中，以纖維素、乳糖為碳源時更能誘導菌種產酶。筆者研究Trichoderma sp.菌種產酶時發現，添加乳糖可以顯著增加培養體系的濾紙酶活，體系內添加10 g/L乳糖可以使濾紙酶活由原始的最高值0.16 IU上升到0.56 IU。葡萄糖主要是提供菌種生長所需能量，對產酶促進作用不大，用同位素14C、3H標記發現葡萄糖是抑制纖維素酶的合成，而不是抑制酶的分泌[11]。

1.2 氮源

在培養基中添加合適的營養成分能夠顯著提高纖維素酶活性，比如適宜的氮源能較好地促進微生物的生長，調控和改善其產酶能力。氮源的種類有很多。不同的菌種適宜的氮源有很大的差異。

目前，在一些研究中發現酵母提取物能夠促進產酶。Aftab等[7]在利用絲狀真菌（T.reesei）產纖維素酶時發現，使用纖維素——酵母提取物的培養基能達到最大酶活性和細胞生長量，FPA達到5.02 U/ml，CMC酶活為4.2 U/ml，并且真菌生物量達14.7 g/L。由此可知，以酵母提取物為氮源能促進酶的產量、活性。類似的發現還有Domingues等[12]在研究T.reesei RUTC30產纖維素酶時也發現酵母提取物能促進菌種的生長、產酶量。筆者等研究發現在Trichoderma sp.菌種產酶的培養體系中加入15 g/L酵母提取物，可以使得體系2 d的濾紙酶活由0.60 IU提高到0.92 IU。

蛋白胨作為比較普遍的氮源也被肯定了其價值。勇強等[13]在研究里氏木霉木聚糖酶和纖維素酶的生物合成時發現在各種氮源中，蛋白胨是最好的氮源，并且在復合氮源中當硫酸銨和尿素的比例為1∶3時，木聚糖酶活力最高，達93.3 IU/ml；當比例為1∶1時，FPA和CMC酶活力達到最大值，分別為0.263和0.026 IU/ml。由此可知，調整不同的氮源比例顯示不同纖維素酶活力。

一些銨鹽、尿素也被用作氮源，并顯示出其對產酶的促進作用。邱雁臨[14]發現，在綠色木霉的纖維素酶酶活培養基中添加氮源（NH4）2SO4 為0.5%時，纖維素酶活性達到較高水平。Deswal等[9]在對產纖維素酶的褐腐菌的培養基條件的優化中，發現以尿素為氮源時可以達到最大產酶量。Vu等[15]經鈷60γ射線、紫外線照射，與N甲基N硝基N亞硝基胍誘變處理后得一突變菌——曲霉菌。在研究其固態發酵優化條件時，發現在培養基中添加氯化銨、尿素、麥芽提取物等氮源能夠顯著提高纖維素酶產量。

目前的研究表明，培養不同菌株的適宜氮源不同。主要的氮源有蛋白胨、酵母提取物、銨鹽、尿素等，且有機氮優于無機氮，銨態氮優于硝態氮，無機氮中以硫酸銨最佳，有機氮中蛋白胨促進產酶的效果最好，并能夠保持菌種良好生長，且被認為是最佳氮源。大量研究也表明，酵母提取物能夠顯著促進菌種產酶，其他氮源也有一定的促進作用。但是，關于它起作用的程度、機制還需進一步研究。

1.3 表面活性劑和未知生長因子

研究表明，一些表面活性劑可以提高菌種的產酶能力。有研究表明，纖維素酶的分泌與細胞膜的通透性有著密切的關系[16]。在綠色木霉QM86培養基中添加一定濃度的油酸鈉、亞油酸鈉、Tween 80和蔗糖單棕櫚酯等表面活性劑，結果表明它們都大量增加纖維素酶產量，且縮短產酶時間。Domingues等[12]研究發現，使用Tween 80能抑制發酵過程中菌絲體形成球狀，促進酶的分泌。有研究表明，在纖維素酶解體系中添加適量的Tween 20，能夠顯著提高纖維素酶的酶解效果[17]。Soni等[18]研究一個多功能的煙曲霉，發現適當濃度的Tween 80（0.24%）能夠促進纖維素酶的產生。這可能是由于表面活性劑的非離子型的刺激作用改變了細胞膜的通透性。Vu等[15]在研究誘變菌株的固態發酵培養時，發現在培養體系中添加吐溫80和EDTA能夠有效地促進纖維素酶的生產。筆者研究發現，添加Tween 80對Trichoderma sp.培養體系4 d的酶活有微弱的促進作用。當Tween 80與酵母提取物聯合添加時對酶活的增加效果與單獨增加酵母提取物的處理沒有顯著的區別。

還有一些離子也起到促進的作用。蒲海燕[19]發現，鈣離子是纖維素酶的重要穩定劑，添加含鈣離子的溶液對酶的產生有顯著的促進效果，NaH2PO4對產酶也有一定的促進作用。有些未知的營養成分對產酶也有效果。據文獻報道，玉米芯有利于β葡萄糖苷酶的生產[20]，同時玉米芯中某些成分對木聚糖酶也有一定的促進作用[21]。這可能與玉米芯除了具有一定的誘導作用外還含有相對較多的可以供菌體生長所利用的營養成分和未知因子有關。

表面活性劑和一些未知生長因子能夠促進菌種產酶?，F在國內外研究較多的為Tween 80的促進作用，其他因子作用很少見報道，由于機理尚不清楚，所以具有一定偶然性。當確定應用表面活性劑和一些未知生長因子時，由于菌種、培養條件有所不同，在應用劑量上需要調試。這些均需要進一步的探索及總結。

2 培養條件的優化

2.1 溫度

在發酵物的培養條件中，溫度對菌種的生長、產酶量的影響很大。研究發現，不同培養溫度下，菌體生長速度、孢子數量、菌落顏色、酶活力高峰期的出現時間均有不同。徐昶等[22]對灰綠曲霉的研究中發現，灰綠曲霉XC9 在較低溫度（25 ℃）下培養，菌體生長緩慢，孢子數量少，呈淺綠色，酶活力高峰期出現晚。在溫度較高（35 ℃）時培養，菌體生長旺盛，孢子多，呈綠色，酶活高峰期出現早，但酶量偏低，表明該菌株產酶較適宜的溫度為30 ℃ 。董志揚等[23]采用物理化學誘變的方法誘變出一株產酶能力較高的菌株T801，發現最適培養溫度為28～30 ℃。同時，發現一些菌種產酶的適宜溫度較高，比如Liu等[24]發現一株耐高溫的產纖維素酶的煙曲霉，在固態發酵下最優產酶溫度為50 ℃。Shu等[25]在研究T.reesei產纖維素酶的影響因子中，菌種的最佳產酶溫度為30 ℃。Gautam等[26]在優化菌種產酶條件的試驗中，發現黑曲霉與木霉的產酶能力要高于其他真菌，并且其最適產酶溫度分別為40和45 ℃。Sohail等[27]在研究曲霉MS82產纖維素酶時發現發酵培養溫度在35 ℃時，酶產量最高。Chandra等[28]利用木霉以青蒿渣為底物進行發酵生產纖維素酶，測得FP酶、內切葡聚糖酶和β葡萄糖苷酶的3種酶產量最高時的培養溫度為28 ℃。 Chu等[29]研究由griseoaurantiacus ZQBC691降解竹葉中的纖維素產酶，發現其最佳培養溫度為30 ℃，此時的CMC濃度為15 g/L，還原糖的最終濃度達到1.60 g/L。

已有的研究表明，當溫度過高時，菌體生長旺盛，酶量偏低。當溫度較低時，菌體生長緩慢，產酶效率低；當溫度處于中間適宜時，菌種的生長和產酶量達到一個理想的平衡狀態。一般，多數菌體產纖維素酶的適宜溫度為28～35 ℃。也有一些耐熱菌的最適產酶溫度較高，可達到40～50 ℃。

2.2 pH

在菌種生長的培養條件中，適宜的pH對其菌體的自身生長、產酶量也起著重要的作用。它是一個重要的衡量指標。曾露[30]等從堆肥化處理的甘蔗葉中分離出一株纖維素酶產生菌，通過調整發酵過程中pH的變化，發現當pH為8時，酶活性相對較高。甄靜等[31]從枯枝敗葉的土壤中分離出一株耐高溫、堿性纖維素酶的真菌，并通過優化培養條件，調整pH，最后鎖定該菌產酶的最適pH為7.5。錢林[32]從黃浦江淀山湖的水底沉積物中篩選、分離得到一株產纖維素酶的菌株，發現該菌株在pH 7.0 的條件下，發酵66 h 后纖維素酶活達到最高值。Gautam等[26]在優化菌種產酶條件的試驗中，為選出最適pH，使黑曲霉與木霉在含有50 ml的優化培養基中培養，設置pH范圍為3.0～9.0，發現兩者的最適pH分別為6.7和6.5。也有的產纖維素酶的菌種經誘變處理后，其最適產酶pH偏酸性，比如Liu等[33]將產纖維素酶菌株經過甲磺酸乙酯（EMS）和紫外線照射處理獲得突變體，改突變體的最適產酶pH是5.7。

研究表明，在菌體產酶的培養條件中，過酸和過堿環境都不利于菌種產酶，一般中性環境下菌體產酶量較理想，也有一些誘變處理后的菌體最適產酶pH與原始出發菌株相比會發生變化。這需要在實際工作中進一步摸索。

2.3 溶氧量

產纖維素酶的菌種中有很多是屬于好養菌。在發酵培養過程中適當的溶氧量既能保證菌體的優良生長，又能促使菌體產酶。氧氣不足，致使菌體生長受限；氧氣過高，致使培養體系蒸發失水，微生物代謝受限。因此，調控好發酵培養時的溶氧量對優化培養條件尤為重要。

實驗室中多采用搖瓶培養的方法，此時的溶氧量由搖床轉速和搖瓶裝液量來實現。劉靖[34]在優化斜臥青霉的產酶條件時，發現載量和轉速過高或過低，都不利于菌種生長、產酶。一般，在500 ml搖瓶中加入100 ml培養基，200 r/min時，其菌種產酶活力最高。搖瓶培養為菌種從實驗室走向生產的必經階段。由于搖瓶培養屬于小規模實驗性質的培養，菌種應用于生產前具體培養條件、產酶條件的摸索需要通過反應器來實現。相關研究表明，在攪拌式生物反應器中培養的菌種細胞生長量和纖維素酶產量相比于在搖床振蕩培養中高出2倍[35]。

從實驗室轉到發酵生產中，影響溶氧量的因素也發生變化，一般在生產中溶氧量的改變通常通過改變轉速和通氣量來實現的。通過通氣量改變溶氧量的方法比較常見。Zhi等[36]研究了溶氧量對里氏木霉的影響，發現在通氣量從0.4提到0.5 VVM過程中，菌絲體的質量濃度也在增加，從2.77 g /L到2.98 g /L，相應產生的濾紙酶活從2.79 IU/ml到2.98 IU/ml，由此看出在一定范圍內，溶氧量增加可以小幅度促使菌種產酶。Shahriarinour等[35]研究了在恒定攪拌速度下，不同溶氧量對由Aspergillus菌種產生的胞外纖維素酶（FPA、CMC酶、β葡萄糖苷酶）產量的影響。結果表明，當空氣飽和度為55%時細胞生長量和纖維素酶產量最大，在40%和80%時都較小，而且在55%時，FPA、CMC酶和β葡萄糖苷酶的活性均最高，分別為2.33、51.10、16.18 U/ml。由此可知，通氣量過高和過低都不利于菌種生長和產酶，通氣量適中較合適。研究還發現，適合菌種生長和適合菌種產酶的溶氧量可能有所不同。Cao等[37]研究了由BH14 Cellulophaga lytica生產CMC酶，在7 L生物反應器中培養微生物、攪拌速度和通氣量共同影響纖維素酶的產量，利用響應面法優化生長和產酶條件，發現適合細胞生長的最佳攪拌速度為395 r/min，通氣量為0.98 VVM，而在生產CMC酶的反應體系中最佳攪拌速度為357 r/min，通氣量為0.55 VVM。

從搖瓶到反應器即從實驗室到生產上的過渡過程中，溶氧量對菌種產酶的影響至關重要。在優化菌種產酶的培養條件下，溶氧量即是保證菌種正常生長所需的必要條件，也是控制菌種產酶的重要因素。大量試驗表明，溶氧量要控制在一定范圍內才能有效地促進菌種生長、產酶。

3 菌種改造

菌種改造是指在人為的條件下，采取物理、化學、生物基因工程等技術手段致使菌體本身的結構發生改變。這種改變是隨機的、不定向的，采取誘變方法獲得新菌種，探究其生長、應用能力。其目的是誘發基因突變，選育出有利于投入生產的優良菌種。其意義在于誘發生物體產生突變后，可從中選擇、培育微生物的新品種。新品種可能具有潛在的應用價值。關于采用不同方法對產纖維素酶菌種進行誘變的研究很多，但是何種誘變方法對纖維素菌種選育最有效，不同誘變方法獲得的菌種是否具有相同的性能，都存在很大的爭議。

3.1 物理誘變

誘變選育中應用較多的是輻射誘變，即用α射線、β射線、γ射線、Χ射線、中子和其他粒子、紫外輻射以及微波輻射等物理因素誘發變異。但是，關于產酶菌種的誘變還是以紫外誘變居多，并且達到理想的效果。

方尚玲等[38]對分離篩選出的1株產纖維素酶活力較高的木霉（CMC 酶活609.5 U/g 干曲、FPA酶活133.8 U/g干曲）進行紫外線及原生質體紫外線復合誘變，得到產酶活力很高的菌株，其CMC 酶活達到1 332.9 U/g干曲，FPA酶活達到301.6 U/g干曲，分別為原始菌株的2.19、2.25倍。Liu等[39]從土壤中分離一株菌株，紫外誘變產纖維素酶菌株，發現暴露于紫外線4 min的條件下酶活達到最高[（107.75 μg/（ml·min）]。韓銘海等[40]通過紫外線和γ射線交替誘變，篩選得到一株高產纖維素酶的突變菌株BE40239，與出發株相比，其產酶能力提高1.3倍，發酵性狀與出發菌株也有明顯的差異。孫君社等[41]以康氏木霉TR為出發菌株，經過紫外線誘變，結合雙層平板分離技術選育出1株纖維素酶活力明顯提高的菌株TR6，并通過對康氏木霉固體發酵培養基、接種量、氮源、培養時間和培養溫度等培養條件的研究，通過測定其所產CMC酶活和FPA，找到最佳的產酶條件，即秸稈粉∶麩皮為 1∶1，固液比為 1∶3，添加硫酸銨為氮源，添加量為2%，接種量5%，30 ℃培養84 h 左右為宜，CMC酶活、FPA分別達到468.27和275.31 U/g。

物理誘變的方法較簡便、快捷，能迅速誘變菌體，但其誘變有不明確性，突變較隨機，需要重復性大量試驗才能確定適宜的誘變條件，獲得產酶活性較高的誘變育種。由于目前該方法仍是一種快捷的方法，被廣泛使用。最普遍的物理誘變方法是紫外誘變，也有一些是射線誘變，還有一些是微波輻射誘變等。

3.2 化學誘變

化學誘變除能引起基因突變外，還具有和輻射相類似的生物學效應，如引起染色體斷裂等，常用于處理遲發突變，并對某特定的基因或核酸有選擇性作用?；瘜W誘變劑主要有烷化劑，常用的有甲基磺酸乙酯（EMS）、乙烯亞胺（EI）、亞硝基乙基脲烷（NEU）、亞硝基甲基脲烷（NMU）、硫酸二乙酯（DES）等；核酸堿基類似物，常用的有5溴尿嘧啶（BU）、5溴去氧尿核苷（BudR）等；抗生素，如重氮絲氨酸、絲裂毒素C等，具有破壞DNA和核酸的能力，造成染色體斷裂。

Chand等[42]用溴乙錠和亞硝基胍復合誘變，在含有兩性霉素B濃度為2 μg /ml 的平板上選育出木霉屬抗性突變株CMV5A10，其FPA酶活、CMC酶活分別是野生菌的2.2 和2.1倍。李西波等[43]用青霉（Penicillium sp.）HK2003為原始菌，經亞硝基胍（NTG）、羥胺復合誘變，篩選出一株高產、穩定的纖維素酶菌株LX2435，其產酶能力由200 U/ml 提高到415 U/ ml，比出發菌株提高2 108倍。對該菌種進行了連續8次繼代培養，結果表明其遺傳性狀穩定。

關于單獨的化學誘變產酶菌株鮮有報道，多數是物理化學復合誘變。這是因為復合誘變可達到更理想的效果?；瘜W誘變所需的試劑一般為劇毒的誘變劑，其作用效果較明顯。尋找到適宜的誘變濃度、條件，能達到較理想的誘變種，但其誘變具有突變性和隨機性，也需要不斷嘗試尋找適宜的條件，一般所用誘變劑較多的是亞硝基胍（NTG），也可以是多種化學誘變及復合誘變，效果會更明顯。

3.3 物理化學復合誘變

物化復合誘變的研究有很多，將兩者結合可達到理想的產酶效果。大量的研究已經證實這一點。Adsul等[44]研究表明，Penicillium janthinellum NCIM1171經硫酸二乙酯處理24 h，然后紫外線處理3 min能得到產酶提高和透明圈明顯的菌株，可在含0.2% 2脫氧D葡萄糖的培養基上迅速生長，最后轉到含1.5% 的2脫氧D葡萄糖的培養基有5個突變體。林建國等[45]利用紫外、硫酸二乙酯和亞硝基胍3種誘變方法對發菌株Trichoderma viride進行誘變育種，得到一突變菌株，其產酶能力最高值為437 U/（g·min），是出發菌株的2.03倍。董志揚等[23]通過γ射線照射和亞硝基胍交替處理，誘變出一株纖維素酶高產菌株T801，與出發菌株相比，其產酶能力提高1.77倍。蘭時樂等[46]以纖維素酶產生菌TP1202為出發菌株，通過微波誘變和硫酸二乙酯、氯化鋰誘變劑誘變，選育到1株纖維素酶高產菌株A。在適宜條件下，其產生的CMC、FPA和棉花糖酶活力分別是出發菌株的107.0%、152.4%和140.5%。管斌等[47]通過利用紫外線、亞硝基胍等對T.reesei進行誘變處理，采用低劑量、反復多次復合誘變處理方法，用以2脫氧葡萄糖為降解產物阻遏物的高效篩選方法，選育得到一株抗分解代謝阻遏的突變株，使得纖維素酶活力提高3倍。武秀琴等[48]以黑曲霉得為出發菌株，通過紫外線（15 W，照射距離30 cm左右，照射時間8 min）、亞硝酸（0.1 mol/L的NaNO3，處理5 min）的復合誘變，復篩得到纖維素高產菌株，纖維素酶、濾紙酶活力分別提高了61.10%、64.01%。Jiang等[49]從來自新加坡的土壤樣品中分離出一種新的T.viride菌株，其突變體是經過甲磺酸乙酯（EMS）處理結合紫外線照射得到的，發現突變體培養液可溶性蛋白含量、FPA酶的活性、β葡萄糖苷酶活性和CMC酶活性分別比野生菌株提高了1.67、2.49、2.16和2.61倍。Li等[50]對T.viride進行微波和紫外線的聯合誘變試驗之后，選擇了7個誘變菌株（MB1～MB7），并且測定它們的CMC酶活。其中的5個（MB1、MB2、MB3、MB5和MB7）顯然有著更強的產酶能力，要強于正常的野生型酶。它們產酶的性狀很穩定，并在長達9代內生產纖維素酶。分子生物學研究表明，突變體MB1、B2、MB3和MB5發生內切葡聚糖酶的堿基突變，但是MB7沒有發生改變。這表明堿基突變引起的內切葡聚糖酶的氨基突變可能會導致纖維素酶產量的提高。

在尋找一個高效降解纖維素的酶生產者的過程中，Fang等[51]利用紫外光照射誘變和N甲基N′硝基氮亞硝基胍（NTG）進行突變，得到枝頂孢屬纖維素降解菌C1，還分離到菌株CF2612。菌株CF2612表現出更高的FPA（17.8 U/ml），要高于親本菌株C1（12.3 U /ml）。CF2612的可溶性蛋白的產量和β葡糖苷酶活性也有顯著提高。Vu等[52]從320個鑒定為曲霉的菌株中篩選纖維素酶生產菌株，進一步的改善方法是通過反復多輪鈷60γ射線輻照、紫外線處理和用N甲基N′硝基N亞硝基胍處理。最好的突變菌株是曲霉突變株XTG4，CMC酶活、濾紙纖維素酶活和β葡萄糖苷酶的纖維素酶活分別比野生菌株提高2.03、3.20、1.80倍。傳代培養19次后，曲霉屬的突變體 XTG4S仍穩定。

物理和化學復合誘變已被國內外學者廣泛應用。一般，利用較常規的射線照射和化學試劑處理，選擇好適宜的誘變時間、劑量，經過多次重復試驗可以獲得所需的高產菌種，誘變后菌株的產酶能力對照原始出發菌株有所提高。近年來，通過誘變方法選育新品種，再利用基因工程法對其機理進行研究已成為一種選育新高產菌種的趨勢，有待更多的科研人員研究發現。

3.4 基因工程法

基因工程技術是提高纖維素酶活的一種高效、便捷的方法。通過改變菌體結構，迅速、直接地改造菌體。Wang等[53]通過與碳代謝阻遏相關的RNA干擾技術來提高康氏木霉菌種產酶，主要是使與產纖維素酶和木聚糖酶相關的代謝產物阻遏調控基因沉默。結果表明，RNA干擾后的菌株在濾紙酶活、內切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活和木聚糖酶活方面分別提高2.1、1.4、0.8和0.8倍?？梢姡琑NA干擾利用在分析基因表達調控機制和提高纖維素酶活方面是可行的。Ma等[54]通過對斜臥青霉中β葡萄糖苷酶基因的異源表達來提高里氏木霉（Trichoderma reesei）的纖維素酶活。該研究將斜臥青霉β葡萄糖苷酶I的編碼序列與T.reesei的纖維二糖水解酶I（cbh1）啟動子進行連接，通過農桿菌介導轉化，轉入里氏木霉Rut30的基因組。與親代菌株相比，2個篩選的轉化菌株中的β葡萄糖苷酶活增加了6～8倍，同時它們的FPA平均增加了30%。Salazar等[55]為了獲取高效的纖維素酶，采用反轉錄PCR的方法，建立白腐真菌（WRF）文庫，從中克隆獲得Polysticus versicolor編碼內切葡聚糖酶的一個基因和Agrocybe aegerita編碼纖維二糖纖維二糖水解酶一個基因，將這些基因在原核系統和真核系統進行重組表達，發現這些新酶具有纖維素酶特性。建立白腐真菌（WRF）文庫也是一個產纖維素酶有前景的方法。

已有研究表明，通過調節纖維素酶產生菌的調控因子可以在不同程度改變酶的產生量。Coradetti等[56]以模式絲狀真菌Neurospora crassa為研究對象，篩選與纖維素降解相關的非特異性轉錄因子，發現轉錄因子 clr1和clr2。系統發育分析結果表明，CLR1和CLR2在多數降解纖維素的絲狀真菌中存在且保守。CLR1對于clr2的表達和纖維二糖的利用是必需的。缺失clr2的Aspergillus nidulans菌株不能誘導纖維素酶基因的表達，且缺乏木聚糖酶活力。為提高T.reesei的纖維素降解能力，Rahman等[57]將egl3和xyn3與β葡萄糖苷酶I編碼區進行同源重組，重組菌株的β葡萄糖苷酶I的活力分別比出發菌株提高4.0、7.5倍。由此可知，通過對產酶菌種的纖維素酶基因進行啟動子的調控，也可以有效地提高纖維素酶的表達量。 陳科等[58]研究了Erwinia chrysanthemi的纖維素酶基因。為提高纖維素酶celY基因在原核細胞中的分泌表達量，分別構建由脂蛋白啟動子、T7啟動子、果膠酶信號肽調控的多種表達載體。與由纖維素酶celY基因自身的啟動子和信號肽調控的表達載體相比，發現由脂蛋白啟動子、T7啟動子、果膠酶信號肽調控的表達載體都在不同程度提高celY基因的分泌表達量。

基因組改組（Genome shuffling）是微生物育種學中的一項新興技術。這種技術的優點是可在微生物遺傳背景未知的條件下改變遺傳性狀[59]。它已被視為是一種快速提高細胞表型的新型基因工程方法，不僅用于改良菌種，而且用于提供復雜的表型信息[60]。目前，這項技術已被應用到提高纖維素酶生產菌產酶能力的研究中，并初見成效。Cheng[61]在研究 Penicillium decumbens JUA10菌種產酶時，經過2輪基因組改組，獲得3個融合子GS215、GS221和GS222，相比于初始菌株，融合子菌株的FPA分別提高100%、109%和94%。當以玉米芯為培養基質時，培養44 h后相比于初始菌株FPA增長117%、142%和118%，結果證實通過基因組改組的方法可以使得菌株更早的大量產酶。Xu等[62] 利用基因組改組技術來增強T.viride產纖維素酶的能力，通過紫外（UV）照射、低能離子注入和常壓非平衡放電等離子體（APNEDP）方法得到初始突變群體。突變群體進行反復原生質體融合后，獲得菌株T.viride F161，其在秸稈中固態發酵培養后纖維素酶活是原始出發菌株的1.97倍。

隨著基因工程技術的發展，利用生物反應器生產纖維素酶，運用基因工程技術在分子水平上對纖維素酶基因進行分子改造，有望解決一些纖維素酶活性（熱穩定性、pH、阻遏性等）低的應用缺陷。但是，通過基因工程方法構建的菌種多數存在著基因結構不穩定的缺陷，且目前大部分纖維素酶基因的表達水平還較低，纖維素酶基因工程的主要難題是如何實現不同組分的有效表達和提高表達量。這些都需要進一步的攻關。無論如何纖維素酶的基因工程研究，目前已得到足夠的重視，并且有望在纖維素酶生產上起到革命性的作用[59]。

4 結語

纖維素酶作為一種高分子復合酶，具有復雜的空間結構且不易分離、純化的特點。纖維素酶的生產歷史較短、規模較小、酶活力也較低，生產工藝需要進一步研究和完善。選擇優良的菌種是提高纖維素酶活力的關鍵，但還需要有適當的生產方法和培養條件才能充分發揮優良菌種的性能，得到較高的酶產量。早在20世紀70年代，國內外就對纖維素酶進行相關的研究。研究表明，大部分的纖維素酶是由細菌、真菌、放線菌等微生物發酵產生的。里氏木霉T.reesei（Hypocrea jecoriha）是迄今為止研究的最為清楚的[63]，并且通過菌種改造、發酵工藝的改進，T.reesei生產纖維素酶的能力得到很大的提高。

目前，人們對真菌和細菌的纖維素酶研究較多，而對放線菌纖維素酶的研究很少，并且纖維素酶的產量和活性都偏低。今后，應加強菌種選育和發酵工藝等基礎研究工作，分離和篩選出高效纖維素分解菌群，并且用分子生物學手段進一步優化菌種，提高酶活。國內外學者對提高纖維素酶活性的方法都在逐漸探索階段，主要集中在微生物分離、選育、產酶條件優化以及一些已知纖維素酶基因的克隆和異源表達，雖在培養條件優化和菌種分子改造方面初有成效，但沒有一種方法能快速提高酶產量，大幅提高酶活性。

纖維素酶的廣泛應用對解決食品短缺、緩解能源危機、減少環境污染、加快工業進程等方面有重要的現實意義。如何篩選纖維素酶高產菌株、提高現有菌種的產酶能力，需要科研工作者們進一步的研究。摸索適合不同菌種的產酶工藝、保持酶活的穩定性是進一步研究的主要內容。通過不斷的努力攻關，纖維素酶的成本會不斷降低，直至實現生物燃料的工業化生產。

參考文獻

[1] 劉萌，戰利，馬紅霞，等.纖維素酶及纖維素酶基因工程學研究進展[J].安徽農業科學，2011，39（16）：9515-9517.

[2] 張喜宏，劉義波，高云航.纖維素酶及纖維素酶產生菌選育的研究進展[J].飼料工業，2009，30（22）：14-16.

[3] 呂雄，趙晶，夏黎明.碳源對里氏木霉纖維素酶誘導合成的影響[J].食品與發酵工業，2010（3）：1-4.

[4] 毛連山，宋向陽，勇強.碳氮比對里氏木霉合成木聚糖酶的影響[J].林產化學與工業，2002（3）：41-44.

[5] 季更生，弦林，陽曹，等.培養條件對綠色木霉發酵生產纖維素酶的影響[J].江蘇科技大學學報：自然科學版，2007，21（6）：133-135.

[6] DASHTBAN M，BUCHKOWSKI R，QIN W.Effect of different carbon sources on cellulase production by Hypocrea jecorina（Trichoderma reesei）strains[J].Int J Biochem Mol Biol，2011，2（3）：274-286.

[7] AFTAB A，PATRICK V.Culturebased strategies to enhance cellulase enzyme production from Trichoderma reesei RUTC30 in bioreactor culture conditions[J].Biochemical Engineering Journa，2008，40：399-407.

[8] MATKAR K，CHAPLA D，DIVECHA J，et al.，Production of cellulase by a newly isolated strain of Aspergillus sydowii and its optimization under submerged fermentation[J].International Biodeterioration & Biodegradation，2013，78：24-33.

[9] DESWAL D，PAL KHASA Y，CHANDER KUHAD R.Optimization of cellulase production by a brown rot fungus Fomitopsis sp.RCK2010 under solid state fermentation[J].Bioresource Technology，2011，102：6065-6072.

[10] PARKA E Y，NARUSE K，KATO T.Improvement of cellulase production in cultures of Acremonium cellulolyticus using pretreated waste milk pack with cellulase targeting for biorefinery[J].Bioresource Technology，2011，102：6120-6127.

[11] 謝天文，劉曉風，袁月祥，等.真菌產纖維素酶的誘導物及其調控機理研究進展[J].應用與環境生物學報，2010，16（3）：440-444.

[12] DOMINGUES F C，QUEIROZ J A，CABRAL J M S，et al.The influence of the culture conditions on mycelial structure and cellulose production by Trichoderma reesi Rut C30[J].Enzyme and Microbial Technology，2000，26：394-401.

[13] 勇強，李樹炎，牧陳，等.氮源對里氏木霉木聚糖酶和纖維素酶生物合成的影響[J].林產化學與工業，2004，24（3）：7-11.

[14] 邱雁臨，王金華，吳周和，等.纖維素酶酶活的影響因子初探[J].湖北農業科學，2003（5）：93-95.

[15] VU V H，PHAM T A，KIM K.Improvement of fungal cellulase production by mutation and optimization of solid state fermentation[J].Mycobiology，2011，39（1）：20-25.

[16] 戴四發，金光明，王立克，等.纖維素酶研究現狀及其在畜牧業中的應用[J].安徽技術師范學院學報，2001，15（3）：32-38.

[17] 陳遠釗，羅俊或，胡佳.酸性淀粉酶菌株的誘變及酶的性質研究[J].中國釀造，2007，166（1）：10-13.

[18] SONI R，NAZIR A，CHADHA B S.Optimization of cellulase production by a versatile Aspergillus fumigatus fresenius strain（AMA）capable of efficient deinking and enzymatic hydrolysis of Solka floc and bagasse[J].Industrial Crops and Products，2010，31：277-283.

[19] 蒲海燕.纖維素酶發酵工藝條件優化研究[D].重慶：西南農業大學，2005.

[20] WANG C，WU G，CHEN C.High Production of βglucosidase by Aspergillus niger on corncob[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，168（1）：58-67.

[21] 田紅梅，江正強，楊紹青.嗜熱擬青霉利用玉米芯產木聚糖酶的發酵條件優化[J].食品與發酵工業，2006，32（5）：1-4.

[22] 徐昶，龍敏南，鄔小兵，等.高產纖維素酶菌株的篩選及產酶條件研究[J].廈門大學學報：自然科學版，2005，44（1）：107-111.

[23] 董志揚，祝令香，巍于，等.纖維素酶高產菌株的誘變選育及產酶條件研究[J].核農學報，2001，15（1）：26-31.

[24] LIU D Y，ZHANG R F，YANG X M，et al.Thermostable cellulase production of Aspergillus fumigatus Z5 under solidstate fermentation and its application in degradation of agricultural wastes[J].International Biodeterioration Biodegradation，2011，65：717-725.

[25] SHU G W，HU Z，WANG H D，et al.Effect of some factors on production of cellulase by Trichoderma reesei HY07[J].Procedia Environmental Sciences，2011，8：357-361.

[26] GAUTAM S P，BUNDELA P S，PANDEY A K，et al.Optimization for the production of cellulase enzyme from municipal solid waste residue by two novel cellulolytic fungi[J].Biotechnology Research International，2011，2011：8.

[27] SOHAIL M，SIDDIQI R，AHMAD A，et al.Cellulase production from Aspergillus niger MS82：effect of temperature and pH[J].New Biotechnology，2009，25（6）：437-441.

[28] CHANDRA M，KALRA A，SHARMA P K，et al.Optimization of cellulases production by Trichoderma citrinoviride on marc of Artemisia annua and its application for bioconversion process[J].Biomass and Bioenergy，2010，34（5）：805-811.

[29] CHU F J，LIN C W，I Y P，et al.Hydrolysis of bamboo cellulose and cellulase characteristics by streptomyces griseoaurantiacus ZQBC691[J].Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers，2012，43（2）：220-225.

[30] 曾露，李群良，嚴偉，等.纖維素酶產生菌的篩選及產酶條件優化[J].化學與生物工程，2012，29（5）：46-48.

[31] 甄靜，王繼雯，謝寶恩，等.一株纖維素降解真菌的篩選、鑒定及酶學性質分析[J].微生物學通報，2011，38（5）：709-714.

[32] 錢林，鄭巧利，付瑾，等.一株高效纖維素降解菌株的分離鑒定及其酶學性質[J].微生物學通報，2010，37（4）：524-528.

[33] LIU Y T，LUO Z Y，LONG C N，et al.Cellulase production in a new mutant strain of Penicillium decumbens ML017 by solid state fermentation with rice bran[J].N Biotechnol，2011，28（6）：733-737.

[34] 劉靖.斜臥青霉纖維素酶液態發酵工藝研究[D].呼和浩特：內蒙古農業大學，2011.

[35] SHAHRIARINOUR M，WAHAB M N A，Ariff A B，et al.Kinetics of cellulose production by aspergillus terreus at various levels of dissolved oxygen tension in a stirred tank bioreactor[J].Bio Resources，2011，6（4）：4909-4921.

[36] ZHI X H，QING L R，SHI Y Y.The influence of pH and dissolved oxygen tension（DOT）on mycelium growth and cellulase production by Trichoderma Reesei[J].Advanced Materials Research，2011，236/238：1005-1013.

[37] CAO W，LEE S U，LI J H，et al.Enhanced production of carboxymethylcellulase by Cellulophaga lytica LBH14 in pilotscale bioreactor under optimized conditions involved in dissolved oxygen[J].Korean Journal of Chemical Engineering，2013，30（5）：1105-1110.

[38] 方尚玲，楊丹丹，錢志偉.高產纖維素酶生產菌的篩選及誘變育種[J].食品與發酵科技，2010，46（1）：13- 17.

[39] LIU J H，WANG F M，ZHAO Q，et al.Study of mutagenesis on the strain producing cellulase[J].Energy Science and Technology，2013，5（1）：54-57.

[40] 韓銘海，黃俊，余曉斌，等.中性纖維素酶高產菌株的誘變選育及產酶條件[J].無錫輕工大學學報，2004，23（3）：85-88.

[41] 孫君社，李雪，董秀芹.纖維素酶高產菌株的選育及產酶條件的研究[J].北京林業大學學報，2002，24（2）：83-85.

[42] CHAND P，ARUNA A，MAQSOOD A M.Nove mutation method for increased cellulose production[J].The Society for Applied Microbiology，2004，98：318-323.

[43] 李西波，劉勝利，王耀民，等.高產纖維素酶菌株的誘變選育和篩選[J].食品與生物技術學報，2006，25（6）：107-110.

[44] ADSUL M G，BASTAWDE K B，VARMA A J.Strain improvement of Penicillium janthinellum NCIM1171 for increased cellulose production[J].Bioresource Technology，2007，98（7）：1467-1473.

[45] 林建國，王常高，王偉平.不同誘變方法提高綠色木霉產纖維素酶的研究[J].安徽農學通報，2008，14（14）：134-136.

[46] 蘭時樂，李立恒，晶王，等.微波誘變結合化學誘變選育纖維素酶高產菌的研究[J].微生物學雜志，2007，27（1）：22-25.

[47] 管斌，孫艷玲，謝來蘇，等.纖維素酶高產菌株的選育[J].中國釀造，2004（4）：18-21.

[48] 武秀琴，王敏.纖維素酶高產菌株的誘變選育[J].安徽農業科學，2008，36（23）：9817-9818.

[49] JIANG L J，GENG A L，HE N，et al.New isolate of Trichoderma viride strain for enhanced cellulolytic enzyme complex production[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2010，111（2）：121-127.

[50] LI J H，YANG H J，ROY B，et al.Enhanced cellulose production of the Trichoder Maviride mutated by microwave and ultraviolet[J].Microbiological Research，2010，165：190-198.

[51] FANG X，YANO S，INOUE H，et al.Strain improvement of Acremonium cellulolyticus for cellulose production by mutation[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2009，107（3）：256-261.

[52] VU V H，PHAM T A，KIM K.Fungal strain improvement for cellulase production using repeated and sequential mutagenesis[J].Mycobiology，2009，37（4）：267-271.

[53] WANG S W，LIU G，YU J T，et al.RNA interference with carbon catabolite repression in Trichoderma koningii for enhancing cellulase production [J].Enzyme and Microbial Technology，2013，53：104-109.

[54] MA L，ZHANG J，ZOU G，et al.Improvement of cellulase activity in Trichoderma reesei by heterologous expression of a betaglucosidase gene from Penicillium decumbens[J].Enzyme and Microbial Technology，2011，49：366-371.

[55] SALAZAR O，GAJARDO I，SALINAS A，et al.Heterologous expression and characterization of novel cellulases from white rot fungi[J].Journal of Biotechnology，2010，150：181.

[56] CORADETTI S T，CRAIG J P，XIONG Y，et al.Conserved and essential transcription factors for cellulase gene expression in ascomycete fungi[J].PNAS，2012，109（19）：7397-7402.

[57] RAHMAN Z，SHIDA Y，FURUKAWA T，et al.Application of Trichoderma reesei cellulase and xylanase promoters through homologous recombination for enhanced production of extracellular betaglucosidase I[J].Biosci Biotechnol & Biochem，2009，73（5）：1083-1089.

[58] 陳科，黃瀟，路蕾，等.不同調控元件驅動下菊歐氏桿菌纖維素酶celY基因在大腸桿菌中表達的研究[J].中國生物工程雜志，2012，32（2）：24-28.

[59] CHENG Y F，SONG X，QIN Y Q，et al.Genome shuffling of Penicillium decumbens to improve its cellulase production[C]//31st Symposium on Biotechnology for Fuels and Chemicals.San Francisco，CA：Inter Continental San Francisco Hotel，2009.

[60] GONG J X，ZHENG H J，WU Z J，et al.Genome shuffling：Progress and applications for phenotype improvement[J].Biotechnology Advances，2009，27（6）：996-1005.

[61] CHENG Y，SONG X，QIN Y.Genome shuffling improves production of cellulase by Penicillium decumbens JUA10[J].Journal of Applied Microbiology，2009，107（6）：1837-1846.

[62] XU F，JIN H J，LI H M，et al.Genome shuffling of Trichoderma viride for enhanced cellulase production[J].Annals of Microbiology，2012，62（2）：509-515.

[63] ARO N，ILMN M，SALOHEIMO A.ACEl 0f Trichoderma reesei is a repressor of cellulose and xylanase expression[J].Apphed and Environmental Microbiology，2003，69（1）：56-65.