拮抗農(nóng)業(yè)致病菌放線菌G5發(fā)酵條件的優(yōu)化

劉楊，王勇（等）

摘要：微生物的發(fā)酵過(guò)程十分復(fù)雜，培養(yǎng)基配方的組成以及培養(yǎng)條件的變化都會(huì)對(duì)菌體的代謝造成很大的影響。為了使抗生素的產(chǎn)量達(dá)到最大化，試驗(yàn)運(yùn)用了Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)放線菌（Actinomycetes）G5進(jìn)行了發(fā)酵條件優(yōu)化。利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響放線菌G5發(fā)酵的諸多相關(guān)因素進(jìn)行評(píng)估并篩選出3個(gè)主要因素，即碳源含量、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間；之后根據(jù)3個(gè)主要因素的作用大小和方向進(jìn)行了最陡爬坡試驗(yàn)；最后運(yùn)用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最優(yōu)值，得出其最優(yōu)培養(yǎng)條件為淀粉含量21.66 g/L、培養(yǎng)溫度27.70 ℃、培養(yǎng)時(shí)間7.75 d。在此條件下，抗生素對(duì)蘋果輪紋病菌的抑菌圈直徑為23.00 mm，與模型預(yù)測(cè)值基本一致。

關(guān)鍵詞：放線菌（Actinomycetes）G5；Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)；最陡爬坡試驗(yàn)；Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)；發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TQ458 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）07-1634-03

Optimization of Fermentation Conditions for Actinomycetes G5

LIU Yang， WANG Yong， KANG Jing-qin， ZHANG Liang

（University of Science and Technology Liaoning， Anshan 114044， Liaoning，China）

Abstract：Microbial fermentation process were very complex due to effects of culture medium composition and culture conditions on cell metabolism. Fermentation conditions for actinomycetes G5 were optimized with Plackett-Burman experimental design， steepest ascent experiments， and Box-Behnken design. Three main factors affecting the fermentation of actinomycetes G5 screened by Plackeet-Burman design were carbon content， temperature and culture days. Then the steepest ascent experiments were conducted based on the action degree and direction of the three main factors. The optimal conditions were finally determined by Box-Behnken design. The results showed that the optimal fermentation condition for actinomycetes G5 were starch content of 21.66 g/L， culture temperature of 27.70 ℃ and culture days of 7.75 d. Under these conditions， the bacterial inhibition diameter of the acquired antibiotics against physalospora piricola was 23.00 mm， equal to the model prediction.

Key words： Actinomycetes G5； Plackett-Burman design； steepest ascent experiment； Box-Behnken； optimization

放線菌（Actinomycetes）G5的次級(jí)代謝產(chǎn)物抗生素對(duì)蘋果輪紋病菌（Physalospora piricola）、黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）等多種農(nóng)業(yè)致病菌有較強(qiáng)的抑制作用[1]。在對(duì)放線菌G5的發(fā)酵過(guò)程中，液體培養(yǎng)基的配方和培養(yǎng)條件對(duì)抗生素的產(chǎn)量都有明顯的影響[2]，因而發(fā)酵條件的優(yōu)化工作就顯得尤為重要。本試驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)放線菌G5的發(fā)酵條件進(jìn)行全面優(yōu)化，以確保抗生素的產(chǎn)量達(dá)到最大。響應(yīng)面法是利用簡(jiǎn)潔精確的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)條件參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的統(tǒng)計(jì)方法[3]。本試驗(yàn)運(yùn)用響應(yīng)面法中的Plackett-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化放線菌G5的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件。應(yīng)用Design-Expert.V.8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，獲得了回歸方程，效果顯著[4]。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 供試材料

放線菌G5及蘋果輪紋病菌均為遼寧科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)考察高氏1號(hào)培養(yǎng)基中的碳源（淀粉）、氮源（KNO3）以及培養(yǎng)條件中的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、接種量和裝液量對(duì)發(fā)酵液中抗生素產(chǎn)量的影響，各因素分別取“-1”、“1”兩個(gè)水平，具體見(jiàn)表1。以抗生素對(duì)蘋果輪紋病菌的抑菌圈大小（直徑，mm）作為檢測(cè)指標(biāo)（濾紙片法）[5]。最終得出對(duì)抗生素產(chǎn)量影響最大的3個(gè)主要因素[6]。

1.2.2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)“1.2.1”試驗(yàn)的結(jié)果確定最陡爬坡試驗(yàn)的爬坡方向和各因素效應(yīng)值的大小，確定變化步長(zhǎng)，快速逼近最優(yōu)區(qū)域[7]。

1.2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用多元二次方程來(lái)擬合因素和響應(yīng)面值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)提取條件，確定最優(yōu)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表2為Design-Expert.V.8.0.6軟件設(shè)計(jì)的12組試驗(yàn)，再利用濾紙片抑菌法得到響應(yīng)值D。用SPSS軟件處理表2中的數(shù)據(jù)，得到各因素的主要效應(yīng)及其顯著性（表3）。

當(dāng)P<0.05時(shí)影響顯著，P<0.01時(shí)影響極顯著。由表3可知，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中抗生素產(chǎn)量的影響為顯著，淀粉含量對(duì)發(fā)酵液中抗生素產(chǎn)量的影響為極顯著。所以可以將對(duì)發(fā)酵液中抗生素產(chǎn)量影響不顯著的因素控制在一個(gè)較好的水平上，選擇3個(gè)影響顯著的因素做進(jìn)一步的響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

由Plackett-Burman試驗(yàn)可知，放線菌G5發(fā)酵條件中淀粉含量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間3個(gè)因素對(duì)抗生素的產(chǎn)量有顯著影響，其中淀粉含量和培養(yǎng)時(shí)間有顯著的正效應(yīng)，應(yīng)增加；培養(yǎng)溫度有顯著的負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減少。根據(jù)3個(gè)因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定其變化方向及步長(zhǎng)進(jìn)行試驗(yàn)[4]。

由表4可知，第3組的試驗(yàn)效果最好，所以以第3組試驗(yàn)各因素的水平作為中心點(diǎn)。

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)來(lái)確定Box-Behnken試驗(yàn)的因素和水平。具體見(jiàn)表5。

根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，進(jìn)一步進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)，共進(jìn)行17組試驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表6。17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可分為兩類，其一是析因點(diǎn)，自變量取值在3因素的各自水平所構(gòu)成的三維定點(diǎn)，共有12個(gè)析因點(diǎn)；其二是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)。零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。對(duì)其試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，其結(jié)果見(jiàn)表7。

由表7可知，模型P值小于0.01，為極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.140 2，不顯著。回歸方程的R2為0.966 9，調(diào)整后的R2為0.924 3，均大于0.8，表明其對(duì)模型擬合的可靠性。利用Design-Expert.V.8.0.6軟件處理數(shù)據(jù)得回歸方程：

D=21.93-0.92X1-0.29X2-0.21X3+0.16X1X2-0.25 X2X3-1.92X12-1.01X22-0.51X32

根據(jù)回歸方程做出響應(yīng)曲面分析，其結(jié)果見(jiàn)圖1至圖3。

從圖1至圖3中可以看出，D值的大小隨著兩個(gè)因素值的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明各交互因子均有一個(gè)最佳組合使D值達(dá)到最大。為了求得最佳值，將擬合方程式分別對(duì)各自變量求偏導(dǎo)等于零。得到如下方程式：

-0.92+0.16X2-3.84X1=0

-0.29+0.16X1-0.25X3-2.02X2=0

-0.21-0.25X2-1.02X3=0

從而求得X1=-0.25，X2=-0.15，X3=-0.17，經(jīng)換算得到各因素實(shí)際對(duì)應(yīng)水平為：淀粉含量X1=21.66 g/L，培養(yǎng)溫度X2=27.70 ℃，培養(yǎng)時(shí)間X3=7.75 d。即當(dāng)?shù)矸酆繛?1.66 g/L、培養(yǎng)溫度為27.70 ℃、培養(yǎng)時(shí)間為7.75 d時(shí)，回歸方程預(yù)測(cè)得D值為22.67 mm。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，在上述條件下D值為23.00 mm。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)運(yùn)用了響應(yīng)面法中的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化放線菌G5的發(fā)酵條件。利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)確定主效應(yīng)因子為淀粉含量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)天數(shù)。利用最陡爬坡試驗(yàn)來(lái)確定3個(gè)主效因子的變化方向和步長(zhǎng)，Box-Behnken試驗(yàn)則用于確定最優(yōu)值，得出其最優(yōu)條件為淀粉含量21.66 g/L、培養(yǎng)溫度27.70 ℃、培養(yǎng)時(shí)間7.75 d。模型預(yù)測(cè)的D值為22.67 mm，經(jīng)驗(yàn)證結(jié)果為23.00 mm。結(jié)果表明模型預(yù)測(cè)與試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果基本一致，用該模型可以合理、有效地預(yù)測(cè)D值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李 晶，安德榮，劉翠娟，等.放線菌S-159-05抑菌活性物質(zhì)的初步研究[J].科技與開(kāi)發(fā)，2007，46（11）：755-757.

[2] 李淑彬，楊勁松，劉 陽(yáng)，等.抗真菌抗生素高產(chǎn)菌株的推理選育及其發(fā)酵調(diào)控研究[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，40（4）：13-16.

[3] 郝學(xué)財(cái)，余曉斌，劉志鈺，等.響應(yīng)面法在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基中的應(yīng)用[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27（1）：38-41.

[4] 陳秉梅，侯志國(guó)，李忠琴，等.基于SAS9.1的芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化[J].計(jì)算機(jī)與應(yīng)用化學(xué)，2011，28（5）：575-579.

[5] 蘇 偉，趙 利，劉建濤，等.黃精多糖抑菌及抗氧化性能研究[J].食品科學(xué)，2007，28（8）：55-57.

[6] 肖懷秋，李玉珍.海金沙草總黃酮提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化[J].氨基酸和生物資源，2010，34（8）：68-72.

[7] DAVIES O L.The Design and Analysis of Industrial Experiments[M]. New York：Hafner Publishing Company，1967.

1.2.2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)“1.2.1”試驗(yàn)的結(jié)果確定最陡爬坡試驗(yàn)的爬坡方向和各因素效應(yīng)值的大小，確定變化步長(zhǎng)，快速逼近最優(yōu)區(qū)域[7]。

1.2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用多元二次方程來(lái)擬合因素和響應(yīng)面值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)提取條件，確定最優(yōu)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表2為Design-Expert.V.8.0.6軟件設(shè)計(jì)的12組試驗(yàn)，再利用濾紙片抑菌法得到響應(yīng)值D。用SPSS軟件處理表2中的數(shù)據(jù)，得到各因素的主要效應(yīng)及其顯著性（表3）。

當(dāng)P<0.05時(shí)影響顯著，P<0.01時(shí)影響極顯著。由表3可知，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中抗生素產(chǎn)量的影響為顯著，淀粉含量對(duì)發(fā)酵液中抗生素產(chǎn)量的影響為極顯著。所以可以將對(duì)發(fā)酵液中抗生素產(chǎn)量影響不顯著的因素控制在一個(gè)較好的水平上，選擇3個(gè)影響顯著的因素做進(jìn)一步的響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

由Plackett-Burman試驗(yàn)可知，放線菌G5發(fā)酵條件中淀粉含量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間3個(gè)因素對(duì)抗生素的產(chǎn)量有顯著影響，其中淀粉含量和培養(yǎng)時(shí)間有顯著的正效應(yīng)，應(yīng)增加；培養(yǎng)溫度有顯著的負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減少。根據(jù)3個(gè)因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定其變化方向及步長(zhǎng)進(jìn)行試驗(yàn)[4]。

由表4可知，第3組的試驗(yàn)效果最好，所以以第3組試驗(yàn)各因素的水平作為中心點(diǎn)。

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)來(lái)確定Box-Behnken試驗(yàn)的因素和水平。具體見(jiàn)表5。

根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，進(jìn)一步進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)，共進(jìn)行17組試驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表6。17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可分為兩類，其一是析因點(diǎn)，自變量取值在3因素的各自水平所構(gòu)成的三維定點(diǎn)，共有12個(gè)析因點(diǎn)；其二是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)。零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。對(duì)其試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，其結(jié)果見(jiàn)表7。

由表7可知，模型P值小于0.01，為極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.140 2，不顯著。回歸方程的R2為0.966 9，調(diào)整后的R2為0.924 3，均大于0.8，表明其對(duì)模型擬合的可靠性。利用Design-Expert.V.8.0.6軟件處理數(shù)據(jù)得回歸方程：

D=21.93-0.92X1-0.29X2-0.21X3+0.16X1X2-0.25 X2X3-1.92X12-1.01X22-0.51X32

根據(jù)回歸方程做出響應(yīng)曲面分析，其結(jié)果見(jiàn)圖1至圖3。

從圖1至圖3中可以看出，D值的大小隨著兩個(gè)因素值的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明各交互因子均有一個(gè)最佳組合使D值達(dá)到最大。為了求得最佳值，將擬合方程式分別對(duì)各自變量求偏導(dǎo)等于零。得到如下方程式：

-0.92+0.16X2-3.84X1=0

-0.29+0.16X1-0.25X3-2.02X2=0

-0.21-0.25X2-1.02X3=0

從而求得X1=-0.25，X2=-0.15，X3=-0.17，經(jīng)換算得到各因素實(shí)際對(duì)應(yīng)水平為：淀粉含量X1=21.66 g/L，培養(yǎng)溫度X2=27.70 ℃，培養(yǎng)時(shí)間X3=7.75 d。即當(dāng)?shù)矸酆繛?1.66 g/L、培養(yǎng)溫度為27.70 ℃、培養(yǎng)時(shí)間為7.75 d時(shí)，回歸方程預(yù)測(cè)得D值為22.67 mm。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，在上述條件下D值為23.00 mm。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)運(yùn)用了響應(yīng)面法中的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化放線菌G5的發(fā)酵條件。利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)確定主效應(yīng)因子為淀粉含量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)天數(shù)。利用最陡爬坡試驗(yàn)來(lái)確定3個(gè)主效因子的變化方向和步長(zhǎng)，Box-Behnken試驗(yàn)則用于確定最優(yōu)值，得出其最優(yōu)條件為淀粉含量21.66 g/L、培養(yǎng)溫度27.70 ℃、培養(yǎng)時(shí)間7.75 d。模型預(yù)測(cè)的D值為22.67 mm，經(jīng)驗(yàn)證結(jié)果為23.00 mm。結(jié)果表明模型預(yù)測(cè)與試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果基本一致，用該模型可以合理、有效地預(yù)測(cè)D值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李 晶，安德榮，劉翠娟，等.放線菌S-159-05抑菌活性物質(zhì)的初步研究[J].科技與開(kāi)發(fā)，2007，46（11）：755-757.

[2] 李淑彬，楊勁松，劉 陽(yáng)，等.抗真菌抗生素高產(chǎn)菌株的推理選育及其發(fā)酵調(diào)控研究[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，40（4）：13-16.

[3] 郝學(xué)財(cái)，余曉斌，劉志鈺，等.響應(yīng)面法在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基中的應(yīng)用[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27（1）：38-41.

[4] 陳秉梅，侯志國(guó)，李忠琴，等.基于SAS9.1的芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化[J].計(jì)算機(jī)與應(yīng)用化學(xué)，2011，28（5）：575-579.

[5] 蘇 偉，趙 利，劉建濤，等.黃精多糖抑菌及抗氧化性能研究[J].食品科學(xué)，2007，28（8）：55-57.

[6] 肖懷秋，李玉珍.海金沙草總黃酮提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化[J].氨基酸和生物資源，2010，34（8）：68-72.

[7] DAVIES O L.The Design and Analysis of Industrial Experiments[M]. New York：Hafner Publishing Company，1967.

1.2.2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)“1.2.1”試驗(yàn)的結(jié)果確定最陡爬坡試驗(yàn)的爬坡方向和各因素效應(yīng)值的大小，確定變化步長(zhǎng)，快速逼近最優(yōu)區(qū)域[7]。

1.2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用多元二次方程來(lái)擬合因素和響應(yīng)面值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)提取條件，確定最優(yōu)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表2為Design-Expert.V.8.0.6軟件設(shè)計(jì)的12組試驗(yàn)，再利用濾紙片抑菌法得到響應(yīng)值D。用SPSS軟件處理表2中的數(shù)據(jù)，得到各因素的主要效應(yīng)及其顯著性（表3）。

當(dāng)P<0.05時(shí)影響顯著，P<0.01時(shí)影響極顯著。由表3可知，培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵液中抗生素產(chǎn)量的影響為顯著，淀粉含量對(duì)發(fā)酵液中抗生素產(chǎn)量的影響為極顯著。所以可以將對(duì)發(fā)酵液中抗生素產(chǎn)量影響不顯著的因素控制在一個(gè)較好的水平上，選擇3個(gè)影響顯著的因素做進(jìn)一步的響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

由Plackett-Burman試驗(yàn)可知，放線菌G5發(fā)酵條件中淀粉含量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間3個(gè)因素對(duì)抗生素的產(chǎn)量有顯著影響，其中淀粉含量和培養(yǎng)時(shí)間有顯著的正效應(yīng)，應(yīng)增加；培養(yǎng)溫度有顯著的負(fù)效應(yīng)，應(yīng)減少。根據(jù)3個(gè)因素效應(yīng)大小的比例設(shè)定其變化方向及步長(zhǎng)進(jìn)行試驗(yàn)[4]。

由表4可知，第3組的試驗(yàn)效果最好，所以以第3組試驗(yàn)各因素的水平作為中心點(diǎn)。

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)來(lái)確定Box-Behnken試驗(yàn)的因素和水平。具體見(jiàn)表5。

根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，進(jìn)一步進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)曲面分析試驗(yàn)，共進(jìn)行17組試驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表6。17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)可分為兩類，其一是析因點(diǎn)，自變量取值在3因素的各自水平所構(gòu)成的三維定點(diǎn)，共有12個(gè)析因點(diǎn)；其二是零點(diǎn)，為區(qū)域的中心點(diǎn)。零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。對(duì)其試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，其結(jié)果見(jiàn)表7。

由表7可知，模型P值小于0.01，為極顯著，失擬項(xiàng)P值為0.140 2，不顯著。回歸方程的R2為0.966 9，調(diào)整后的R2為0.924 3，均大于0.8，表明其對(duì)模型擬合的可靠性。利用Design-Expert.V.8.0.6軟件處理數(shù)據(jù)得回歸方程：

D=21.93-0.92X1-0.29X2-0.21X3+0.16X1X2-0.25 X2X3-1.92X12-1.01X22-0.51X32

根據(jù)回歸方程做出響應(yīng)曲面分析，其結(jié)果見(jiàn)圖1至圖3。

從圖1至圖3中可以看出，D值的大小隨著兩個(gè)因素值的增加呈先升高后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明各交互因子均有一個(gè)最佳組合使D值達(dá)到最大。為了求得最佳值，將擬合方程式分別對(duì)各自變量求偏導(dǎo)等于零。得到如下方程式：

-0.92+0.16X2-3.84X1=0

-0.29+0.16X1-0.25X3-2.02X2=0

-0.21-0.25X2-1.02X3=0

從而求得X1=-0.25，X2=-0.15，X3=-0.17，經(jīng)換算得到各因素實(shí)際對(duì)應(yīng)水平為：淀粉含量X1=21.66 g/L，培養(yǎng)溫度X2=27.70 ℃，培養(yǎng)時(shí)間X3=7.75 d。即當(dāng)?shù)矸酆繛?1.66 g/L、培養(yǎng)溫度為27.70 ℃、培養(yǎng)時(shí)間為7.75 d時(shí)，回歸方程預(yù)測(cè)得D值為22.67 mm。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，在上述條件下D值為23.00 mm。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)運(yùn)用了響應(yīng)面法中的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)優(yōu)化放線菌G5的發(fā)酵條件。利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)確定主效應(yīng)因子為淀粉含量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)天數(shù)。利用最陡爬坡試驗(yàn)來(lái)確定3個(gè)主效因子的變化方向和步長(zhǎng)，Box-Behnken試驗(yàn)則用于確定最優(yōu)值，得出其最優(yōu)條件為淀粉含量21.66 g/L、培養(yǎng)溫度27.70 ℃、培養(yǎng)時(shí)間7.75 d。模型預(yù)測(cè)的D值為22.67 mm，經(jīng)驗(yàn)證結(jié)果為23.00 mm。結(jié)果表明模型預(yù)測(cè)與試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果基本一致，用該模型可以合理、有效地預(yù)測(cè)D值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李 晶，安德榮，劉翠娟，等.放線菌S-159-05抑菌活性物質(zhì)的初步研究[J].科技與開(kāi)發(fā)，2007，46（11）：755-757.

[2] 李淑彬，楊勁松，劉 陽(yáng)，等.抗真菌抗生素高產(chǎn)菌株的推理選育及其發(fā)酵調(diào)控研究[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，40（4）：13-16.

[3] 郝學(xué)財(cái)，余曉斌，劉志鈺，等.響應(yīng)面法在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基中的應(yīng)用[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2006，27（1）：38-41.

[4] 陳秉梅，侯志國(guó)，李忠琴，等.基于SAS9.1的芽孢桿菌發(fā)酵條件優(yōu)化[J].計(jì)算機(jī)與應(yīng)用化學(xué)，2011，28（5）：575-579.

[5] 蘇 偉，趙 利，劉建濤，等.黃精多糖抑菌及抗氧化性能研究[J].食品科學(xué)，2007，28（8）：55-57.

[6] 肖懷秋，李玉珍.海金沙草總黃酮提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化[J].氨基酸和生物資源，2010，34（8）：68-72.

[7] DAVIES O L.The Design and Analysis of Industrial Experiments[M]. New York：Hafner Publishing Company，1967.