烏司他丁注射液改善急性肺損傷兔循環內皮祖細胞成血管能力及對PKB／eNOS／NO 通路的影響

王海峰，郭偉新，謝南姿，李 健，沈 藝

急性肺損傷時內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）參與到肺泡－毛細血管的修復，2008 年內皮祖細胞移植至油酸誘導的急性肺損傷兔模型［1］的研究已證實在急性肺損時內皮祖細胞可歸巢到肺毛細血管，起到修復肺損傷的作用。烏司他丁注射液（ulinastatin injection，UTI）減輕急性肺損傷程度，現有的研究認為烏司他丁可減輕肺部炎癥，減少炎癥細胞浸潤及炎癥因子釋放［2－4］。烏司他丁是否引起肺泡毛細血管內皮改變現暫無研究。PKB／eNOS／NO 通路在內皮祖細胞的成血管能力及歸巢有著重要作用［5］，并且最新的研究表明烏司他丁可引起AKT 表達上升［6］，但未進行下游通路的研究，為此，本課題進行烏司他丁是否作用于該通路進一步研究，觀察烏司他丁注射液對急性肺損傷循環內皮祖細胞血管生成能力及對PKB／eNOS／NO 通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年新西蘭大耳白兔（2.5kg～3.0 kg）共50只（購自廣東省動物中心），均為雄性，根據國家實驗動物健康使用規范指南飼養，所有操作符合廣東省人民醫院倫理委員會的要求。

1.2 材料與試劑 M199培養液、胎牛血清購自Hyclone公司；人淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品有限公司；體外血管形成試劑盒、DIL－labeled acetylated LDL（Dil－acLDL）、FITC 標記荊豆凝集素Ⅰ（FITCUEA－1）、Oleicacid（75mg／kg）均購自Sigma公司；NO檢測試劑盒（武漢博士德），烏司他丁注射液（天普洛安）。

1.3 方法

1.3.1 分組方法 體外細胞實驗共分為5組，每組8只。對照組：抽取10mL外周血分離誘導內皮祖細胞7d后，行內皮祖細胞鑒定。48h 后，檢測成血管能力，NO、PKB、eNOS 蛋白表達水平。急性肺損傷組：造模成功24h后，抽取10mL 外周血，分離誘導內皮祖細胞，48h后，檢測成血管能力，NO、PKB、eNOS蛋白表達水平。烏司他丁治療組：造模成功24h后，抽取10mL外周血，分離誘導內皮祖細胞。內皮祖細胞加入1 000U／mL烏司他丁培養48h后，檢測成血管能力，NO、PKB、eNOS 蛋白表達水平。烏司他?。玃KB阻斷劑（LY－294002）組：造模成功24h 后，抽取10mL 外周血，分離誘導內皮祖細胞。內皮祖細胞加入1 000U／mL烏司他丁及LY－294002（5μmol／L）培養48h后，檢測成血管能力，NO、PKB、eNOS蛋白表達水平。烏司他?。玡NOS 阻斷劑（L－NAME）組：造模成功24h后，抽取10mL 外周血，分離誘導內皮祖細胞。內皮祖細胞加入1 000 U／mL 烏司他丁及LAME（1×104μmol／mL）培養48h后，檢測成血管能力，NO、PKB、eNOS蛋白表達水平。

1.3.2 EPCs的分離培養 肝素抗凝取骨髓10mL，采用密度梯度離心法獲取單個核細胞，接種在24孔板上。應用M199培養基（含20%胎牛血清，青霉素100 U／mL，鏈霉素100 U／mL）培養，培養4d 換液，用PBS洗去非貼壁細胞。換培養液后培養至7d，PBS液去除非貼壁細胞，對貼壁細胞進行細胞鑒定。

1.3.3 EPCs的鑒定 按2×106～3×106接種在纖連蛋白包被24孔板，細胞玻片培養第4天取出，將細胞與2.4ng／mL的DIL－acLDL在37℃下孵育1h，以檢測EPCs攝取DIL－acLDL。采用2%多聚甲醛固定細胞10 min。應 用PBS 清 洗2 min，10ng／mL 的FITC－UEA－1加于上述標本，37 ℃下孵育1h。采用激光共聚焦顯微鏡鑒定DIL－acLDL 和FITC－UEA－1雙染色陽性細胞被認為是正在分化的內皮祖細胞。

1.3.4 EPCs血管生成能力檢測 采用體外血管生成試劑盒檢測體外EPCs的血管生成能力。200倍倒置顯微鏡下觀察小血管生成情況。細胞拉長變形，長度為寬度的4倍以上即可被認為形成小管。選擇200倍光鏡下5個視野，計數小管數。

1.3.5 Western Blot檢測PKB、eNOS、VEGF 蛋白表達水平 按照參考文獻和本室已經建立的常規方法進行。PKB、eNOS、VEGF 各種分子抗體均可通過商業化購買獲得（Cell Signaling Technology公司。垂直電泳分離蛋白，對于小分子量蛋白采用半干轉（Bio－RAD 半干轉儀），而大分子蛋白采用濕轉，將蛋白轉至PVDF膜上，相應一抗4 ℃搖床孵育過夜，使用對應二抗孵育2h，PBS沖洗后ECL 化學發光法曝光感光底片，顯影定影洗滌，掃描底片經過Band Scan圖像分析軟件半定量分析目的蛋白條帶。

1.3.6 采用硝酸還原酶法測定培養液上清NO 的含量 NO 化學性質活潑，在體內代謝很快轉化為硝酸鹽（NO3－）和亞硝酸鹽（NO2－），而NO2－進一步轉化為NO3－，利用硝酸還原酶特異性將NO3－還原為NO2－，通過顯色深淺測其濃度的高低。測定方法按照一氧化氮測定試劑盒說明書來操作。

1.4 統計學處理 采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，數據用均數±標準差）表示，組間比較采用方差分析。

2 結 果

2.1 內皮祖細胞鑒定 共聚焦顯微鏡觀察EPCs攝取熒光雙染陽性×200DiL－acLDL 染色細胞呈紅色；FITC－UEA－I染色細胞呈綠色；雙染色細胞同時呈紅、綠色。通過共聚焦顯微鏡鑒定，FITC－UEA－I和DiLacLDL雙染色陽性細胞被認為是正在分化的EPCs。

2.2 體外EPCs血管生成能力比較 急性肺損傷組較正常對照組體外成血管數目下降，差異有統計學意義（P ＜0.05）；烏司他丁治療組較急性肺損傷組體外成血管數目增加，差異有統計學意義（P ＜0.05）；烏司他丁＋LY294002組、烏司他?。獿－NAME 組較烏司他丁治療組體外成血管能力下降，差異有統計學意義（P ＜0.05）。詳見表1。

表1 各組體外成血管數目比較

表1 各組體外成血管數目比較

與正常對照組比較，1）P ＜0.05；與烏司他丁治療組比較，2）P ＜0.05。

組別 n 血管數目正急常性對肺照損組傷組66 6467..8333±±35..534 51）2）烏司他丁治療組 6 61.67±7.06烏烏司司他他丁?。獿LYN29A4M00E2組組 66 3393..5607±±183.9.2671）12））2）

2.3 PKB、eNOS蛋白表達比較 急性肺損傷組較正常對照組PKB、eNOS表達增加，但差異無統計學意義（P ＞0.05）；烏司他丁治療組較急性肺損傷組PKB、eNOS蛋白表達上升，差異有統計學意義（P ＜0.05）；烏司他?。獿Y294002 組、烏司他丁＋L－NAME 組PKB、eNOS蛋白表達較烏司他丁治療組下降，差異有統計學意義（P ＜0.05）。詳見表2。

表2 各組PKB、eNOS蛋白表達比較

表2 各組PKB、eNOS蛋白表達比較

與正常對照組比較，1）P ＜0.05；與烏司他丁治療組比較，2）P ＜0.05。

組別 n PKB eNOS正常對照組 6 0.10±0.05 0.04±0.01急性肺損傷組 6 0.38±0.072） 0.05±0.012）烏司他丁治療組 6 0.64±0.081） 0.18±0.151）烏司他?。獿Y294002組 6 0.31±0.092） 0.06±0.01）2）烏司他丁＋L－NAME組 6 0.09±0.022） 0.05±0.01）2）

2.4 NO 含量比較 烏司他丁治療組較急性肺損傷組NO 濃度上升，差異有統計學意義（P ＜0.05）；烏司他?。獿Y294002組、烏司他?。獿－NAME 組較烏司他丁治療組NO 濃度下降，差異有統計學意義（P ＜0.05）。詳見表3。

表3 各組NO 含量比較 μmol／L

表3 各組NO 含量比較 μmol／L

與正常對照組比較，1）P ＜0.05；與烏司他丁治療組比較，2）P ＜0.05。

組別 n NO正常對照組 5 6.64±0.47急烏烏烏性司司司肺他他他損丁丁丁傷治＋＋LL組療Y－N 組29 A 4M0 0E2組組 5555 7954....4345 8644±±±±0100....8256 4328 2122））））

3 討 論

通過體外細胞培養直接觀察烏司他丁對內皮祖細胞的功能影響。內皮祖細胞的遷移、分化，最終是用于內皮修復及血管新生，而內皮祖細胞的成血管能力是以上功能的綜合反映，更能體現內皮祖細胞功能。本研究選擇內皮祖細胞的成血管能力作為觀察指標，發現經烏司他丁干預后，兔循環內皮祖細胞體外成血管的能力較急性肺損傷組細胞成血管功能上升。

在體外進行細胞培養同樣發現烏司他丁組治療后內皮祖細胞的成血管能力提高，并且這種能力的提高可以被PKB、eNOS阻斷劑阻斷。因此，認為烏司他丁作用于內皮祖細胞，導致內皮功能改善，修復肺泡毛細血管屏障，減少肺部滲出，其機制可能有PKB／eNOS／NO 通路參與。

烏司他丁改善內皮祖細胞成血管功能的機制是因為其減輕炎癥因子表達和炎癥細胞浸潤導致內皮保護，還是通過其他途徑導致內皮祖細胞功能改善這是本課題解決的問題。已有研究表明PKB／eNOS／NO通路是調節內皮祖細胞生物學功能的重要信號途徑，多種細胞因子、藥物通過此信號通路作用于內皮祖細胞的歸巢、分化［7］。烏司他丁是否通過PKB／eNOS／NO 通路改善內皮祖細胞功能？

本實驗在動物模型中觀察到急性肺損傷肺組織PKB、eNOS減少，經烏司他丁治療后兔肺組織PKB、eNOS表達上升。在體外培養的血管內皮祖細胞檢測也有同樣的趨勢。NO 是PKB／eNOS的下游產物，可直接介導內皮祖細胞功能提高［8，9］。本實驗結果可見在烏司他丁治療后內皮祖細胞NO 上升，經L－NAME、LY294002 阻 斷 劑 后NO 含 量 下 降。在 體外成血管結果中發現內皮祖細胞的成血管功能在烏司他丁治療后明顯提高與NO 的變化一致。在本研究中急性肺損傷時NO 較正常對照組升高，但差異無統計學意義，經烏司他丁治療后這種趨勢增加，與正常對照組比較差異有統計學意義。在急性肺損傷時大量的炎癥因子分泌造成內皮祖細胞損傷，這種損傷導致內皮功能下調，經治療可有效改善，在本研究中表現為經烏司他丁治療后內皮祖細胞成血管功能明顯上調。在本研究中使用了PKB阻斷劑（LY294002）與eNOS阻斷劑（L－NAME），經烏司他丁治療后NO 及成血管能力提高，給予PKB阻斷劑后NO 和成血管能力下降，考慮為烏司他丁直接作用于PKB 或PKB 以上的通路，最新的研究也證明烏司他丁可引起PKB表達上升［6］。

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