利用可重復使用的URA3標記基因建立熱帶假絲酵母基因敲除系統

項崢，陳獻忠，張利華，沈微，樊游，陸茂林

1. 江南大學生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122；

2. 江蘇省微生物研究所有限責任公司，無錫 214063

利用可重復使用的URA3標記基因建立熱帶假絲酵母基因敲除系統

項崢1，陳獻忠1，張利華1，沈微1，樊游1，陸茂林2

1. 江南大學生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室，無錫 214122；

2. 江蘇省微生物研究所有限責任公司，無錫 214063

熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)在發酵工業中具有重要的應用潛力，但二倍體遺傳結構和較低的遺傳轉化效率限制了其代謝工程育種技術的應用。建立可靠的遺傳轉化技術并高效的刪除目的基因是代謝工程改造熱帶假絲酵母的重要前提。文章以C. tropicalis ATCC 20336為出發菌株，通過化學誘變篩選獲得了尿嘧啶缺陷型突變株C. tropicalis XZX(ura3/ura3)。以丙酮酸脫羧酶(Pyruvate decarboxylase，PDC)基因作為靶基因構建了兩端包含同源臂并在選擇性標記C. tropicalis URA3(Orotidine-5′-phosphate decarboxylase，乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶)基因兩側同向插入源于沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的hisG序列的基因敲除盒PDC1-hisG-URA3-hisGPDC1(PHUHP)，并轉化宿主菌株C. tropicalis XZX，篩選獲得PHUHP片段正確整合到染色體的PDC基因位點的轉化子XZX02。在此基礎上，將轉化子 XZX02涂布于5-FOA(5-氟乳清酸)選擇培養基上，篩選得到URA3基因從PHUHP片段中丟失的營養缺陷型菌株XZX03。進一步構建了第2個PDC等位基因的刪除表達盒PDCm-URA3-PDCm，并轉化C. tropicalis XZX03菌株，獲得轉化子C. tropicalis XZX04。經PCR和DNA測序確認轉化子C. tropicalis XZX04細胞染色體上的兩個PDC等位基因被成功敲除。文章建立了一種營養缺陷型標記可重復使用的熱帶假絲酵母遺傳轉化技術，利用該技術成功敲除了細胞的 PDC基因，為進一步利用代謝工程改造熱帶假絲酵母奠定了基礎。……