降鈣素基因相關肽對滑膜來源間充質干細胞增殖與成骨分化的調控作用

王 浩，陳 森，馬雨洪，姚惟琦

(1武昌醫院，武漢430063;2武漢大學基礎醫學院)

骨組織為高度血管化的結締組織，在體內一直處于持續的更新替代過程中。大塊骨缺損、萎縮性骨不連和骨質疏松等諸多情況都需要大量骨組織［1］。臨床上最常用的骨組織材料為同種異體骨或自體骨。同種異體骨移植有潛在的傳染疾病和導致過敏的風險。同時，自體骨移植的骨量來源有限且會損害取骨部位。骨組織工程為解決臨床上骨組織的需要帶來了曙光。目前骨組織工程大部分是研究骨髓來源的間充質干細胞(MSCs)。但是通過骨髓抽吸來獲取骨髓來源的MSCs不僅會對人體帶來巨大傷害，而且能夠獲取的細胞數目也十分有限。從不同組織獲取的MSCs細胞具有不同的增殖和分化特性。最新的研究顯示，滑膜來源MSCs(SMSCs)具有更強的增殖和成骨分化能力［2］。研究顯示降鈣素基因相關肽(CGRP)可能也參與了骨的代謝過程。在成骨細胞中過表達CGRP的轉基因小鼠骨密度會增加而缺乏CGRP表達的小鼠會發生骨量減少［3］。本研究探討了CGRP對SMSCs增殖與成骨分化的調控作用，為將CGRP干預后的細胞作為骨組織工程中的種子細胞，最終應用于體內環境下骨缺損的修復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 DMEM培養基、F12培養基、胎牛血清(Gibco公司)，Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、10 mmol/L β-甘油磷酸、100 nmol/L地塞米松、0.1 mmol/L抗壞血酸、CGRP(Sigma公司)，一抗、辣根過氧化物酶偶聯二抗(Santa Cruz公司)，TRIzol Reagent(Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒、Taq聚合酶、dNTP(MBI公司)，CCK-8增殖試劑盒(日本同仁)，IQ SYBR Green supermix(Bio-Rad公司)，堿性磷酸酶定量檢測試劑盒(南京建成生物科技公司)，蛋白定量檢測試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 SMSCs的分離、培養及鑒定 12周齡的SD大鼠均購自湖北中醫藥大學實驗動物中心，所有的動物實驗相關操作都通過了醫院倫理委員會批準。麻醉狀態下處死大鼠后，無菌條件下分離大鼠雙側膝關節內的滑膜組織，并用顯微剪刀將滑膜組織剪成碎屑。PBS清洗數次后，用0.25%的胰酶在37℃條件下消化5 min，再用0.1%的Ⅱ型膠原酶在37℃條件下消化3 h。然后離心收獲、培養基重懸細胞并用40 μm濾網過濾獲得單細胞懸液。最后將細胞種植于25 cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2孵箱內培養，并標記為原代。以后每隔2 d換液1次，并于換液后在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況和形態特征。待細胞接近融合時用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2的比例傳代。SMSCs第1次傳代培養后可見細胞呈雙極或多極紡錘體樣形狀，細胞可貼壁并快速生長。傳代后第3代細胞形態均一，呈紡錘體樣形狀。繼續傳代培養，細胞形態無明顯改變。采用流式細胞儀檢測第3代細胞表面標記，細胞的百分比CD13占93.3% ±1.4%，CD44占97.2% ±2.7%，CD105占94.6% ±2.2%。形態學和流式細胞術結果初步確定本實驗中成功分離出SMSCs。

1.3 CGRP誘導SMSCs的增殖和成骨分化 選取第3代SMSCs細胞進行增殖和成骨分化實驗。胰酶消化貼壁細胞后，以1.5×104/mL的密度接種細胞，第2天后換液。

增殖實驗中細胞分兩組，分別為對照組和實驗組。其中對照組為普通DMEM/F12培養基，實驗組為普通DMEM/F12培養基加10-8mol/L的CGRP。實驗組和對照組分別每隔1 d換液1次。采用CCK-8法檢測細胞活性。CGRP誘導SMSCs增殖0、2、4、6、8 d 后，消化細胞并將細胞以每孔 100 μL的體積加入96孔板中，然后每孔中再加入10 μL的CCK-8溶液。將培養板于孵育箱內避光孵育1 h后，在450 nm波長下檢測每孔儀器上顯示的吸光度值，最后再將吸光度值比轉化為相應的細胞數目比。

成骨分化實驗中細胞分兩組，對照組為單純成骨誘導液，實驗組為成骨誘導液加10-8mol/L的CGRP。成骨誘導液成分為含10%胎牛血清的DMEM，10 mmol/L 的 β-甘油磷酸，100 nmol/L 的地塞米松，0.1 mmol/L抗壞血酸。實驗組和對照組分別每隔1 d換液1次。CGRP誘導SMSCs成骨分化5、10 d后，收獲成骨分化的細胞，并進行堿性磷酸酶活性定量檢測。用堿性磷酸酶定量檢測試劑盒進行檢測，將細胞裂解，加入緩沖液震蕩15 min。然后加入堿性磷酸酶底物反應30 min，最后加入0.05 mol/L的氫氧化鈉終止反應。測量405 nm處的吸光度值。用蛋白定量試劑盒進行蛋白定量檢測。測定的吸光度值與相應蛋白定量的比值即為標準化的堿性磷酸酶活性(OD值/mg蛋白/30 min)。

采用RT-PCR法對SMSCs細胞內增殖相關基因〔細胞周期素D1(Cyclin D1)、增殖細胞核抗原(PCNA)〕和成骨分化相關基因〔Runx2、骨形態發生蛋白2(BMP-2)〕表達水平進行檢測。收集CGRP誘導增殖后7 d和成骨分化后7 d的細胞，并使用TRIzol分別提取各組細胞的總RNA，按逆轉錄試劑盒的操作步驟逆轉錄得到cDNA，并選取逆轉錄產物進行實時熒光定量RT-PCR。引物標記采用熒光染料SYBR GreenⅠ。Cyclin D1引物序列:上游5＇-TGCGTGCAGAGGGAGATTGT-3＇，下游 5＇-GCGGATAGAGTTGTCAGTGTAGATG-3＇;PCNA 引物序列:上游 5＇-AAGGGCTGAAGATAATGCTGATAC-3＇，下 游5＇-CATATACGTGCAAATTCACCAGAT-3＇;Runx2 引物序列:上游 5＇-CCAGATGGGACTGTGGTTACTG-3＇，下游 5＇-TTCCGGAGCTCAGCAGAATAA-3＇;BMP-2 引物序列:上游 5＇-GCCCTTTTCCTCTGGCTGAT-3＇，下游 5＇-TTGACCAACGTCTGAACAATGG-3＇;GAPDH 引物序列:上游 5＇-TATGACTCTACCCACGGCAAGT-3＇，下游 5＇-ATACTCAGCACCAGCATCACC-3＇。反應結束后在PCR儀上讀取Ct值，并通過計算機軟件進行相應計算，得出基因的相對表達量，以GAPDH為內參。

1.4 統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較用成組t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

CGRP誘導SMSCs增殖第0天實驗組、對照組細胞數目比分別為1、1;第2天分別為1.14±0.03、1.25±0.05，兩組比較P＞0.05;第4天分別為1.34±0.08、1.40±0.07，兩組比較 P ＜0.05;第 6天分別為1.76±0.12、1.89±0.14，兩組比較 P ＜0.05;第8天分別為1.84±0.13、2.35±018，兩組比較P＜0.05。CGRP誘導SMSCs成骨分化第5天實驗組、對照組堿性磷酸酶活性分別為1.38±0.05、1.00±0.02，第 10天分別為 1.75±0.10、1.44±0.06，兩組比較P 均 ＜0.05。兩組Cyclin D1、PCNA、Runx2、BMP-2基因表達水平比較結果見表1。

表1 兩組 Cyclin D1、PCNA、Runx2、BMP-2基因表達水平比較(±s)

表1 兩組 Cyclin D1、PCNA、Runx2、BMP-2基因表達水平比較(±s)

注:與對照組比較，*P＜0.05

Cyclin D1 PCNA BMP-2 Runx2實驗組 2.23±0.08* 3.38±0.50* 2.81±0.12* 1.67±0.10組別*對照組1.46±0.07 1.74±0.12 1.92±0.08 1.12±0.05

3 討論

骨組織工程可以為臨床上因創傷、骨腫瘤或骨先天發育畸形等情況導致的大量骨缺損提供足量且安全的骨組織［4，5］。骨組織工程的研究中，大部分的研究重點都集中于骨髓來源的 MSCs［6，7］。但是關于SMSCs研究一直相對不足。最近的研究顯示，SMSCs相對于其他組織來源的MSCs而言，具有更強的增殖和成骨分化潛能，這使得SMSCs成為新的研究熱點［8］。Lee 等［9］學者進一步研究顯示，聯合應用SMSCs和富含血小板的血漿能夠顯著修復兔動物模型中的骨軟骨缺損。Moriguchi等［10］研究表明以SMSCs為種子細胞并利用無支架技術體外構建組織工程團塊能夠修復豬模型中半月板的缺損，可有望用于抑制半月板的退變和延緩創傷性關節炎的發展。CGRP對骨細胞特別是成骨細胞的作用近年來受到廣泛關注。Tian等［11］研究表明，CGRP能夠顯著促進人成骨樣細胞中BMP-2的表達和增殖，也能夠促進去成骨分化相關基因如堿性磷酸酶、骨鈣素等的表達。也有研究顯示CGRP可以促進成骨細胞的增殖，且過表達CGRP基因的小鼠骨量會發生明顯上調。通過靜脈注射CGRP能夠顯著預防因卵巢切除而導致的雌性大鼠骨量丟失［12］。

實驗中我們發現，CGRP可以顯著促進SMSCs細胞的增殖和分化。CCK-8法檢測顯示CGRP可以促進SMSCs細胞的增殖，堿性磷酸酶活性定量結果顯示CGRP可以促進SMSCs細胞的成骨分化。我們進一步利用RT-PCR對SMSCs細胞內增殖和成骨分化相關基因表達水平進行檢測。結果表明CGRP可以促進SMSCs細胞中增殖相關基因Cyclin D1和PCNA的表達，成骨分化相關基因BMP-2和Runx2的表達。其中Cyclin D1在調節細胞周期中十分關鍵，其激活能夠促進細胞增殖且其過度激活是許多腫瘤細胞的特征，對腫瘤的診斷和預后判斷也有積極的意義［13］。PCNA在細胞增殖的啟動上起重要作用，是反映細胞增殖狀態的良好指標［14］。BMP-2為TGF-β超家族細胞因子的成員之一，它在MSCs成骨分化過程中起到了重要的作用，BMP-2能夠顯著促進MSCs的成骨分化［15］。Runx2的另一個名稱為Cbfα1，它是間充質干成骨分化過程早期關鍵的轉錄因子之一［16］。我們的實驗結果初步表明，CGRP在調控SMSCs的增殖和成骨分化過程中發揮著十分關鍵的作用。但CGRP如何促進SMSCs細胞增殖和分化的具體分子機制依然有待進一步的實驗研究。我們初步推測CGRP可能通過激活經典的Wnt通路并抑制細胞凋亡來達到促進SMSCs細胞增殖和成骨分化的效果，CGRP也有可能通過OPG/RANKL/RANK分子軸來達到促進SMSCs增殖和成骨分化。

本實驗中成功分離出SMSCs細胞，并進一步證實CGRP可以促進SMSCs細胞的增殖和成骨分化。

［1］Dimitriou R，Jones E，McGonagle D，et al.Bone regeneration:current concepts and future directions［J］.BMC Med，2011，(9):66.

［2］Yoshimura H，Muneta T，Nimura A，et al.Comparison of rat mesenchymal stem cells derived from bone marrow，synovium，periosteum，adipose tissue，and muscle［J］.Cell Tissue Res，2007，327(3):449-462.

［3］Schinke T，Liese S，Priemel M，et al.Decreased bone formation and osteopenia in mice lacking alpha-calcitonin gene-related peptide［J］.J Bone Miner Res，2004，19(12):2049-2056.

［4］Rosset P，Deschaseaux F，Layrolle P.Cell therapy for bone repair［J］.Orthop Traumatol Surg Res，2014，100(1 Suppl):107-112.

［5］Samavedi S，Whittington AR，Goldstein AS.Calcium phosphate ceramics in bone tissue engineering:a review of properties and their influence on cell behavior［J］.Acta Biomater，2013，9(9):8037-8045.

［6］安偉德，胡祥，曹亮，等.骨髓間充質干細胞定向分化肝細胞及肝內移植研究［J］.中華實驗外科雜志，2005，22(8):917-919，1026.

［7］吳永超，鄭啟新，謝宗平，等.骨髓間充質干細胞表達神經營養因子及治療脊髓損傷的研究［J］.中華實驗外科雜志，2005，22(2):139-141.

［8］Chang CH，Chen CC，Liao CH，et al.Human acellular cartilage matrix powders as a biological scaffold for cartilage tissue engineering with synovium-derived mesenchymal stem cells［J］.J Biomed Mater Res A，2013.

［9］Lee JC，Min HJ，Park HJ，et al.Synovial membrane-derived mesenchymal stem cells supported by platelet-rich plasma can repair osteochondral defects in a rabbit model［J］.Arthroscopy，2013，29(6):1034-1046.

［10］Moriguchi Y，Tateishi K，Ando W，et al.Repair of meniscal lesions using a scaffold-free tissue-engineered construct derived from allogenic synovial MSCs in a miniature swine model［J］.Biomaterials，2013，34(9):2185-2193.

［11］Tian G，Zhang G，Tan YH.Calcitonin gene-related peptide stimulates BMP-2 expression and the differentiation of human osteoblastlike cells in vitro［J］.Acta Pharmacol Sin，2013，34(11):1467-1474.

［12］Valentijn K，Gutow AP，Troiano N，et al.Effects of calcitonin gene-related peptide on bone turnover in ovariectomized rats［J］.Bone，1997，21(3):269-274.

［13］Yan GJ，Yu F，Wang B，et al.MicroRNA miR-302 inhibits the tumorigenicity of endometrial cancer cells by suppression of Cyclin D1 and CDK1［J］.Cancer Lett，2014，345(1):39-47.

［14］Madhumati G，Kavita S，Anju M，et al.Immunohistochemical Expression of Cell Proliferating Nuclear Antigen(PCNA)and p53 Protein in Cervical Cancer［J］.J Obstet Gynaecol India，2012，62(5):557-561.

［15］Madl CM，Mehta M，Duda GN，et al.Presentation of BMP-2 mimicking peptides in 3D hydrogels directs cell fate commitment in osteoblasts and mesenchymal stem cells［J］.Biomacromolecules，2014，15(2):445-455.

［16］Song I，Kim K，Kim JH，et al.GATA4 negatively regulates osteoblast differentiation by downregulation of Runx2［J］.BMB Rep，2013.