miRNA398調控煙草Cu/Zn-SOD基因的表達

周小龍，魏春陽，黃 佳，史艷梅，王 皓，羅朝鵬，李 鋒，王 燃*，楊 軍，陳繼峰，林福呈

1.鄭州大學生命科學學院，鄭州高新技術產業開發區科學大道100號 450001

2.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001

3.中國煙葉公司，北京宣武區廣安門外大街9號 100055

植物在正常生長條件下和逆境中均能產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），并產生一套復雜有效的系統來維持體內活性氧的平衡［1-2］。在正常生長條件下，植物細胞產生的活性氧能及時被自身的抗氧化系統清除，而當植物處于干旱、淹水、病害和紫外輻射等逆境中時，將導致細胞內大量活性氧的積累，若不及時清除會對細胞造成嚴重傷害。超氧自由基（O2-·）是活性氧中的一種，是葉綠體光合系統Ⅰ電子傳遞過程的產物，O2-·應及時在其合成的部位被清除以免產生危害更大的羥基自由基，完成這一任務的是Cu/Zn超氧化物歧化酶（Cu/Zn-Superoxide Diamutase,Cu/Zn-SOD），該酶和O2-·產生的位置均位于細胞葉綠體的類囊體上。Bowler等［3］的研究發現，氧化脅迫可以誘導Cu/Zn-SOD基因的表達來清除過多的O2-·。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）是生物體有效清除活性氧的重要抗氧化酶類［4］。Cu/Zn-SOD與植物的抗旱、抗鹽堿、耐低溫高溫等多種抗逆性狀密切相關［5］。miRNA是一類內源的、長約20~24個堿基的RNA分子，通過mRNA降解和翻譯抑制等方式，特異地對靶基因進行轉錄后調控。miRNA調控Cu/Zn-SOD基因表達水平的研究源于模式植物擬南芥，有研究表明，Cu/Zn-SOD基因的表達水平取決于miRNA398水平［6］。當植物處于正常生長情況下Cu/Zn-SOD基因進行正常轉錄，但由于在miRNA398介導下的降解過程其轉錄產物并不累積，植物受到逆境脅迫（干旱）時miRNA398的表達受到抑制，導致Cu/Zn-SOD基因轉錄產物的積累，植物進而表現出抗氧化能力。轉基因研究結果表明，miRNA398在調控Cu/Zn-SOD基因表達和逆境脅迫中發揮著重要作用［6］。煙草是一種重要的經濟作物，其抗逆性尤其是抗旱能力受到普遍關注。煙草miRNA398是否具有調控其Cu/Zn-SOD基因表達的生物學功能，能否通過調控Cu/Zn-SOD基因的表達來實現對逆境脅迫的響應目前尚未見報道。因此，研究和比較了兩個煙草品種在正常與逆境脅迫條件下miRNA398和Cu/Zn-SOD基因表達量的變化，并分析了miRNA398結合Cu/Zn-SOD基因的靶位點，旨在揭示煙草miRNA398的生物學功能。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 煙苗培養

選用白肋煙B37和烤煙CB-1品種，采用l/3濃度的Hoagland完全營養液水培，具體操作參照田陽陽等的方法［7］。對照組按正常條件管理，干旱處理采用含20%PEG6000（質量體積比）的培養液水培處理2 d后取樣。取樣時煙株根系先用自來水沖洗，最后用去離子水沖洗干凈。吸水紙吸干表面水分后分開根、莖和葉取樣。液氮速凍后超低溫冰箱中保存，用于RNA提取。

1.1.2 試劑和試劑盒

DNA聚合酶、DNA酶、PMD-19-sample-T載體、One Step PrimeScript?miRNA cDNA合成試劑盒、小RNA提取試劑盒、熒光定量PCR試劑SYBR Premix Ex Taq II和RNA反轉錄試劑盒均為日本Takara公司產品。

1.1.3 引物

根據煙草（Nicotiana tabacum）Cu/Zn-SOD的CDS保守序列設計引物，用于克隆基因全長編碼區引物：上游引物P1 5’-ATGTCAACGGGACCAC-3’，下游引物P2 5’-TTAACCCTGGAGGCC-3’；用于mRNA熒光定量PCR擴增引物：上游引物P3 5’-ATGTCAACGGGACCAC-3’，下游引物P4 5’-TTAACCCTGGAGGCC-3’；miRNA 前體引物，上游引物P5為5’-TGTGTTCTCAGGTCGCCCCTG-3’，下游引物P6為小RNA提取試劑盒自帶的Uni-miR定量PCR引物；熒光定量PCR內參基因Actin引物：上游引物5’-CTGGCATTGCAGATCGTATA-3’，下游引物5’-GCGCC ACCACCTTGA TCTT-3’。 除自帶引物外，其他引物由寶生物工程有限公司商業合成，純度為PAGE級。

1.2 試驗方法

1.2.1 葉綠素含量的測定

參照曾建敏等［8］的方法測定葉綠素含量，并采用SPSS分析軟件進行數據分析。

1.2.2 煙草小RNA和總RNA的提取

采用小RNA提取試劑盒提取煙草葉片小RNA，使用Trizol法提取總RNA。1.2.3 單鏈cDNA的合成

以所提取的RNA為模板反轉錄得到cDNA。按照RNA反轉錄試劑盒說明書，以Oligo（dT）18為引物合成總RNA的cDNA第一鏈。

1.2.4 定量PCR檢測基因的表達

小RNA為模板反轉錄得到cDNA，分別以miRNA398和Actin引物進行定量PCR反應。反應體系為25μL：SYBR Green PCR Master Mix 12.5μL，miRNA398前體引物 P5（10μmol/L）和Uni-miR定量PCR引物（P6，10μmol/L）各1μL，cDNA模板2μL，滅菌水 8.5μL。反應程序：95 °C預變性3 min；95 °C變性15 s，58 °C退火20 s，72 °C延伸20 s，39個循環；72 °C 延伸10 min。每個PCR反應重復3次。內參基因Actin的PCR采用同樣的程序。

總RNA為模板反轉錄得到cDNA，分別以Cu/Zn-SOD和Actin引物進行定量PCR反應。反應體系為20μL：SYBRPremix Ex Taq II 10μL，引物 P3和P4（10μmol/L）各1μL，cDNA模板2μL，滅菌水6μL。反應程序：95°C預變性3 min；95°C變性15 s，52°C退火20 s，72°C延伸20 s，39個循環；72°C延伸10 min。內參基因Actin的PCR采用同樣的程序。每個待測樣品cDNA設置3次重復,對得到的 3 個 Cp 值取平均值,用 2-ΔΔCp法計算［9］。

2 結果與分析

2.1 兩個品種煙草葉片葉綠素的含量比較

經測定，白肋煙B37的總葉綠素含量比CB-1低（表1）。表1結果表明，CB-1干旱處理后葉綠素含量下降34%，而B37下降45%。同一品種干旱處理后的葉綠素含量比正常條件下降低，說明干旱導致煙草植株質體膜系統受損，引起葉綠體超微結構損傷，葉綠素降解，從而表現為葉綠素含量減少。因此，色素含量分析表明B37比CB-1更容易受到干旱脅迫的損傷。

表1 不同處理煙草樣品中的葉綠素含量 （mg/g）

2.2 miRNA398的表達分析

對干旱和對照共4個樣品得到的小RNA進行了miRNA398的表達量分析，熒光定量PCR的結果（圖1）表明，烤煙CB-1經過干旱脅迫后，miRNA398的表達水平上調，而白肋煙B37經過干旱脅迫后，miRNA398的表達水平下降；且干旱脅迫后CB-1體內的miRNA398表達量顯著高于B37，說明miRNA398參與了干旱脅迫的響應，且兩個品種對干旱脅迫表現出正應答和負應答兩種不同的響應方式。擬南芥受干旱脅迫后，通過miRNA398調控靶基因Cu/Zn-SOD清除植物細胞中活性氧，從而提高植物對逆境反應的耐受性［6］。因此，需要進一步驗證兩個品種煙草體內Cu/Zn-SOD基因表達的變化。B37體內miRNA398在干旱脅迫條件下表達量下降，可能會引起Cu/Zn-SOD基因表達量的進一步提高而應對逆境脅迫。CB-1體內miRNA398在干旱脅迫條件下表達量上升，因此Cu/Zn-SOD基因表達量可能下降，推測CB-1體內可能是其他的抗氧化機制在應對干旱脅迫，說明miRNA398在兩個品種體內對相同脅迫產生了不同的響應。抗旱能力較弱的B37可能是通過低表達miRNA398而獲得Cu/Zn-SOD基因的高表達來彌補其抗逆能力的不足。

圖1 miRNA398在不同煙草品種中的相對表達量

2.3 Cu/Zn-SOD基因在不同樣品中的相對表達情況

對4種處理的樣品得到的總RNA進行了Cu/Zn-SOD的表達量分析，熒光定量PCR的結果（圖2）表明，正常條件下B37體內的Cu/Zn-SOD表達量顯著低于CB-1；在干旱脅迫條件下，B37體內miRNA398表達水平下調，造成靶基因Cu/Zn-SOD的表達量顯著提高。Cu/Zn-SOD基因是脅迫信號的應答因子，在正常條件下，Cu/Zn-SOD作為一種抗氧化酶可以將有害的超氧自由基轉化為過氧化氫，盡管過氧化氫仍是對機體有害的活性氧，但植株體內的過氧化氫酶和過氧化物酶可以將其完全分解為水，使植物細胞內活性氧的產生與清除處于動態平衡［4］。干旱條件下葉綠素合成受阻，自由基含量上升，Cu/Zn-SOD表達量上升消除了自由基對植物細胞帶來的損傷，葉綠素降解減緩，說明B37可能通過低表達miRNA398來提高Cu/Zn-SOD基因的表達量以彌補活性氧清除能力的不足；同時干旱脅迫條件下，miRNA398的表達量進一步下降，引起Cu/Zn-SOD基因表達量的進一步提高，從而增強了煙株的抗氧化能力來應對逆境脅迫。正常情況下，雖然Cu/Zn-SOD基因被轉錄，但由于miRNA398所介導的特異降解，Cu/Zn-SOD的mRNA并不積累。在干旱脅迫條件下，miRNA398的表達量降低，解除了對Cu/Zn-SOD基因的抑制，即Cu/Zn-SOD基因的mRNA表達量升高。有研究［6］顯示，表達具有miR398抗性的Cu/Zn-SOD基因擬南芥突變體，Cu/Zn-SOD基因 mRNA表達量增高，其蛋白卻沒有增加，這表明miR398可能是通過抑制靶標的翻譯進而對靶基因進行負調控。而CB-1在經過干旱處理后，miRNA398的表達水平上調，Cu/Zn-SOD基因的表達量降低，可能是其產生了更加復雜的抗氧化機制。

圖2 Cu/Zn-SOD基因在不同煙草樣品中的相對表達量

2.4 miRNA398和Cu/Zn-SOD基因的結合位點

在植物和動物發育過程中，miRNA和靶mRNA結合的程度和部位不同，會造成不同的作用方式。動物的miRNA多數與其靶mRNA的3′端非翻譯區的識別位點以不完全互補的方式結合，以阻礙翻譯機器對該mRNA的翻譯來調控基因表達。絕大多數的植物miRNA與其靶mRNA的互補位點相似［10］。圖3顯示，煙草miR398與Cu/Zn-SOD基因的5′非翻譯區（5′UTR）有16個堿基互補配對，說明miR398與Cu/Zn-SOD基因的作用位點（結合互補區域）位于該基因的5′UTR。

圖3 miRNA398和Cu/Zn-SOD基因結合位點分析

3 結論和討論

煙草miRNA398與Cu/Zn-SOD基因mRNA作用的位點在該基因的5′UTR區域，表明煙草miRNA398可能參與抑制Cu/Zn-SOD基因的表達。兩個煙草品種miRNA398調控Cu/Zn-SOD基因表達對于干旱脅迫的響應不同，干旱脅迫條件下CB-1的miRNA398表達水平上升，B37的miRNA398表達水平下降，而對應CB-1的Cu/Zn-SOD基因表達水平下降，B37的Cu/Zn-SOD基因表達水平上升。對于煙草不同品種相同基因出現不同的表達模式，已有研究發現［11］14個煙草品種中Cu/Zn-SOD基因對于低溫弱光脅迫的反應不同，表明其生物學功能在不同品種中可能發生了變化。但miRNA398調控Cu/Zn-SOD基因對逆境脅迫的響應機制尚需要更多的證據。

miRNA398通過介導Cu/Zn-SOD基因mRNA的降解，在多個不同脅迫中可能充當共同的應答元件［12］，與植物響應逆境脅迫密切相關；脅迫響應基因的表達多數受轉錄因子調控，同時在染色質水平、RNA水平和蛋白質水平也受到精細的調控［13］。如miRNA398是植物在銅素缺乏條件下介導銅素蛋白穩定的重要調控因子［14］。miRNA398家族包括miRNA398a，miRNA398b和miRNA398c，Yamasaki等［15］對擬南芥 miRNA398 進行順式作用元件分析，在miRNA398b和miRNA398c的啟動子區域分別發現了8個GTAC序列，而GTAC序列是生物體缺銅應答的必需元件。miRNA398的表達主要依賴于轉錄因子SPL7直接結合到miRNA398啟動子區的GTAC序列。本研究推測miRNA398在兩個煙草品種間存在不同的抗逆響應機制，因此，miRNA398的遺傳學特征和轉錄調控機制尚有待進一步研究。

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