膽總管囊腫患者與巨細(xì)胞病毒感染關(guān)系的相關(guān)性

許沈南?李佳杰?盧旭生?張偉亮

【摘要】 目的 探索人巨細(xì)胞病毒感染與膽總管囊腫的相關(guān)性。方法 使用人巨細(xì)胞病毒熒光定量PCR分別對25例膽總管囊腫和20例對照組患者肝臟組織進(jìn)行檢測， 同時進(jìn)行病理染色和人巨細(xì)胞病毒晚期蛋白免疫組化檢測。結(jié)果 對照組均為檢測到陽性結(jié)果， 實驗組中， 人巨細(xì)胞病毒陽性14例（陽性率56%）。免疫組化結(jié)果顯示陽性蛋白多位于肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥浸潤細(xì)胞當(dāng)中， 膽管上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。結(jié)論 膽總管囊腫與人巨細(xì)胞病毒感染之間存在密切相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】 巨細(xì)胞病毒感染；膽總管囊腫

先天性膽總管囊腫（congenital choledochal cyst， CCC）是一種伴有膽汁淤積的外科膽道疾病， 是膽道系統(tǒng)常見先天畸形[1]。小兒膽總管囊腫穿孔在小兒時期很少見， 一旦出現(xiàn)則病情重， 早期診斷較困難， 其發(fā)病機(jī)理至今尚不清楚。在臨床診治中發(fā)現(xiàn)巨細(xì)胞病毒（cytomegalo virus）與穿孔有一定的關(guān)聯(lián)[2]， 相關(guān)實驗也提示該病與人巨細(xì)胞病毒感染之間存在相關(guān)性。因此本實驗對膽總管囊腫患者及對照組患者肝臟組織中的人巨細(xì)胞病毒進(jìn)行檢測， 為檢驗和論證膽總管囊腫與人巨細(xì)胞病毒感染之間的相關(guān)性問題提供實驗數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 新鮮肝臟組織標(biāo)本源自普寧市人民醫(yī)院2010年～2013年施行手術(shù)的25例膽總管囊腫患者， 其中男13例， 女12例。全部病例手術(shù)時年齡在2～8歲， 平均（4±2）歲。同時收集對照組病例20例， 均來自于本院意外死亡尸檢小兒。

1. 2 方法 全部行B超及CT檢測， 診斷為膽總管囊腫， 手術(shù)中進(jìn)一步探查， 證實為膽總管囊腫。術(shù)中切取直徑約1 cm的肝右葉邊緣組織， 分成兩份， 一份用甲醛固定， 另一份于-80℃超低溫冰箱中保存。

2 主要試劑及設(shè)備

DNA提取試采用 QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit， 人巨細(xì)胞病毒檢測使用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的核酸擴(kuò)增熒光定量檢測試劑盒， HCMV 晚期蛋白PP65單克隆抗體購自美國 USCNLIFE 公司， 為兔抗人單克隆抗體， 其余免疫組化試劑均購自DAKO公司。

3 熒光定量PCR

取約40 mg的肝臟標(biāo)本提取DNA， 提取過程嚴(yán)格按照QIAGEN公司QIAamp DNA Mini Kit操作說明書進(jìn)行。熒光定量PCR反應(yīng)條件及結(jié)果判定均按照相應(yīng)的試劑盒說明書進(jìn)行， 反應(yīng)結(jié)束后使用7300 system SDS software進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。具有反應(yīng)條件， 詳見表1。

表1 5種病毒FQ-PCR反應(yīng)條件

病毒名稱 第一步 第二步 第三步 第四步

HCMV 93℃ 2 min 93℃ 45 s，55℃ 60 s，10個循環(huán) 93℃ 30 s 55℃ 45 s，30個循環(huán)

4 病理及免疫組織化學(xué)染色

肝臟組織使用甲醛固定后， 包埋成石蠟塊并進(jìn)行切片。病理染色方法包括HE 染色和MASSON染色。于此同時， 采用二步法對人巨細(xì)胞病毒晚期蛋白PP65進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色， 以包漿內(nèi)有明顯棕黃色為陽性。

5 結(jié)果

5. 1 人巨細(xì)胞病毒在膽總管囊腫組織中的感染率 PCR結(jié)果顯示：25例膽總管囊腫患者肝臟組織中， HCMV陽性者14例子， 陽性率56%， 對照組20例HCMV均為陰性。

5. 2 膽總管囊腫組織病理變化 膽總管囊腫患者肝臟組織病理結(jié)果顯示：肝小葉有不同程度的變性壞死， 部分可見肝多核巨細(xì)胞， 匯管區(qū)膽栓形成， 膽小管增生， 膽道上皮細(xì)胞變性。以膽小管為中心， 炎癥細(xì)胞侵潤， 不同程度的纖維束包裹膽小管。詳見圖1。

5. 3 膽總管囊腫組織PP65分布情況 PCR檢測HCMV檢測陽性者， PP65免疫組化染色可見：PP65 均位于感染細(xì)胞胞漿當(dāng)中， 陽性細(xì)胞多較集中分布于肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞和炎性浸潤細(xì)胞， 膽道上皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)。詳見圖2。

6 討論

CMV是一種DNA病毒。HCMV是人體最常見的機(jī)會性感染病毒之一。用檢測方法調(diào)查HCMV感染率， 發(fā)達(dá)國家人群感染率40%～60%， 發(fā)展中國家95%～99%。近年來， 隨著研究的深入， 很多學(xué)者已認(rèn)識到膽總管囊腫不能簡單歸于先天性疾病， 而更可能是圍生期的一種進(jìn)行性病變。其明顯的季節(jié)和地區(qū)聚集趨勢的特點提示該病可能與環(huán)境中某種感染因素的損傷有關(guān)[2]。隨后相關(guān)的研究也表明病毒感染與膽總管囊腫存在相關(guān)性[3]。

但具體是哪一種病毒卻值得探索， 近年來人們采用多種方法對膽總管囊腫和多種病毒感染之間的相關(guān)性問題進(jìn)行研究， 相關(guān)研究也證實該病與多種病毒之間存在相關(guān)性， 其中主要病毒包括呼腸病毒、輪狀病毒和巨細(xì)胞病毒3大類[4-6]。

本實驗使用PCR方法直接檢測患者肝臟組織當(dāng)中HCMV的陽性率， 并使用尸檢患兒肝臟組織作為對照組， 實驗結(jié)果顯示膽總管囊腫患者的陽性率高達(dá)56%， 而對照組則未有陽性病例。此數(shù)據(jù)與國內(nèi)董永綏等[7]進(jìn)行大規(guī)模前瞻性研究得出的普通嬰幼兒CMV肝炎發(fā)生率（42%）相比， 提示BA病因為HCMV感染的可能。進(jìn)一步提示了膽總管囊腫與巨細(xì)胞病毒的相關(guān)性。

于此同時， 作者注意到膽總管囊腫患者的膽道上皮細(xì)胞上HCMV晚期蛋白PP65的表達(dá)呈強(qiáng)陽性， 且膽道上皮細(xì)胞亦出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。提示HCMV對膽總管囊腫患兒的膽道上皮細(xì)胞具有侵襲性， 可誘發(fā)膽道上皮細(xì)胞的凋亡， 從而影響膽小管的功能與結(jié)構(gòu)。

將通過動物學(xué)實驗進(jìn)一步證實本次研究的檢測結(jié)果， 將HCMV打入到胎鼠當(dāng)中， 觀察其膽道的變化。HCMV與膽總管囊腫之間存在相關(guān)性， 可謂臨床上膽總管囊腫的防治提供科研依據(jù)， 造福患兒。

參考文獻(xiàn)

[1] Alford CA， Stagno S， Pass RF， Britt WJ.Congenital and Perinatal cytomegalovirus infections.Res Infect Dis ， 1990， 125Suppl7：S745-753.

[2] Wu T C， Hruban R H， Ambinder R F， et al. Demonstration of cytomegalovirus nucleic acids in the coronary arteries of transplanted hearts. The American journal of pathology， 1992， 140（3）： 739.

[3] 馮杰雄.病毒感染與膽總管囊腫的關(guān)系.實用兒科臨床雜志， 2007， 22（ 23）：1761-1763.

[4] Szavay PO， Leonhardt J， Czech-Schmidt G， et al. The role of reovirus type 3 infection in an established murine model for biliary atresia. Eur J Pediatr Surg， 2002， 12（4）：48-50.

[5] Bobo L， Ojeh C， Chiu D， et al. Lack of evidence for rotavirus by polymerase chain reaction/enzyme immunoassay of hepatobiliary samples from children with biliary atresia. Pediatr Res， 1997， 41（2）：229-234；

[6] De Tommaso AM， Andrade PD， Costa SC， et al. High frequency of human cytomegalovirus DNA in the liver of infants with extra-hepatic neonatal cholestasis. BMC Infect Dis， 2005， 12（1）：108；

[7] 董永綏， 方峰， 魏晶， 等.巨細(xì)胞病毒感染的母嬰傳播研究.中國實用兒科雜志， 2000， 15（3）： 334-335.

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