毛細管電泳分離蛋白質的研究進展

宮紅梅

摘 要 綜述了無膠篩分毛細管電泳在和蛋白質的分離分析中的應用實例，對這種方法的前景展望及發展趨勢進行

討論。

關鍵詞 高效毛細管電泳；無膠篩分；蛋白質；電滲流

中圖分類號：O629.73 文獻標識碼：A 文章編號：1671-7597（2014）07-0160-01

近年來，蛋白質組學的研究進展迅速，其中研究熱點集中于蛋白質的分離檢測與結構鑒定上。目前有關蛋白質的研究手段和方法較多，各有優缺點。毛細管電泳技術具有高效、快速、樣品用量極少等特點，適合生物大分子的分析檢測。但毛細管電泳分離蛋白質時，首先要解決的問題是蛋白質樣品對管壁的吸附。

無膠篩分毛細管電泳是在緩沖溶液中添加線性高分子而不進行交聯反應，溶液中高分子之間相互交纏形成網孔，從而對蛋白質等生物大分子按其大小進行篩分分離，無膠篩分的機制還不明確，存在幾種理論模型：交纏溶液理論和高分子亞濃溶液線團收縮理論，Ogston、爬行和偏爬行模型和碰撞模型[1]。高分子溶液加入到緩沖液中，使電滲流得到抑制，同時也抑制了蛋白質的吸附，與凝膠電泳相比，它的制備工藝相對簡單，壽命較長，操作簡便，容易清洗等優點。

傳統的SDS-凝膠電泳分離蛋白質的分辨率低，操作繁瑣耗時，且所用藥品有毒性，毛細管凝膠電泳可以克服上述缺點，但制備工藝復雜，凝膠壽命短，填充過程中容易產生氣泡，影響分離。無膠篩分電泳具有更多的優點，容易填充和沖出，高分子聚合物在管中形成動態篩分網絡，能很好的保持操作重現性，而且可以抑制電滲流，減少吸附。而且可以選擇篩分介質的種類，濃度，分子量，以適合分離不同的蛋白質混合物。

1 無膠篩分毛細管電泳的應用

目前，無膠篩分體系已較多應用于低聚核苷酸、DNA限制性片段、聚合酶鏈反應產物的分離研究領域中。郭栩等人根據實驗結果得出結論，在無膠篩分體系中，盡管影響分離的主要因素在于篩分體系本身，但柱壁的處理對DNA片段的分離結果也不可忽視[3]。

李克，袁倚盛等在硼酸緩沖溶液中加適量的PEG8000作為改性劑，以非涂漬毛細管柱電泳分離人血清蛋白質，血清樣品經硼酸緩沖液（50 mmol/L，pH=8.80）稀釋后，以0.1 mol/L的硼酸緩沖液（pH9.35，PEG8000為4 g/L）為電泳介質，在50 μm×37 cm彈性石英毛細管柱（Leff=32 cm）中進行電泳分離，在紫外波長200 nm處檢測，12 min內便可完成對血清中蛋白質的電泳分離。方法簡便、快速、峰遷移重復性好，適用于臨床常規檢驗和血中蛋白質的研究。張振中，吳逸明等以線性高分子聚合物聚乙二醇（PEG20000）作為篩分介質，150 mmol/L Tris -100 mmol/L CHES（pH8.7）作為運行緩沖液，運行電壓20 kV，磷酸化酶B、牛血清白蛋白、肌動蛋白、碳酸酐酶、煙草花葉病毒外殼蛋白和胰蛋白酶抑制劑達到基線分離。隨PEG相對分子質量的不同PEG的性質發生改變，相對分子質量大小決定了其鏈的長短及篩孔徑的大小，也就決定了被分離的蛋白質的相對分子質量范圍。因此選定合適的PEG，優化實驗參數是實驗的關鍵工作。在實驗中應根據趙京山，溫進坤等人建立了檢測微量蛋白質方法，電泳緩沖液為含有30 g/L PEG 20000硼酸鹽緩沖液150 mmol/L，pH10.0，骨橋蛋白標品的倍比稀釋，依次經NGSCE方法檢測，確定所建方法的靈敏度及峰面積和OPN濃度之間的關系；利用回收實驗，根據OPN的濃度和峰面積計算回收率。結果表明，該無膠篩分毛細管電泳的方法能滿足檢測微量蛋白質的需要[3]。

Garcia-Ruiz等[4]分離牛乳清蛋白（α-乳清蛋白和β-乳球蛋白（A+B））和大豆蛋白時使用的是羥乙基甲基纖維素/尿素體系。Rumbo等[5]同樣用無膠篩分體系成功分析50多種結構相似、理化性質接近的麥膠蛋白。Bean等通過比較幾種不同的篩分介質在SDS-CE中的分離效果，建立了簡捷，快速，重現性好的分離小麥蛋白的方法。Somerville等[6]用無膠篩分體系實現了臨床應用的糖細胞集落刺激因子（G-CSF）的異構體的

分離。

2 影響因素及控制

zeta電勢是影響電滲流的主要因素，緩沖液性質、毛細管表面特性都與電勢大小密切相關。同時，zeta電勢與擴散層厚度成正比，而擴散層厚度又與電解質濃度的平方根倒數成正比，所以，緩沖溶液的組成、酸堿度、毛細管內壁表面的活化狀態以及環境溫度成為影響電滲流的間接因素，此外，當其他條件一定時，電場強度也影響電滲流的大小。控制方法有改變緩沖液的特性，對柱表面進行處理，外加徑向電場。

分離酸性蛋白質時，采用pH7-10的緩沖體系，可以減少蛋白質對管壁的吸附。不同的緩沖離子類型會對電滲流以及蛋白質樣品有不同的作用，硼酸-硼砂緩沖溶液和Tris-HCl緩沖溶液的分離能力優于磷酸鹽緩沖液，能得到較好的峰形和較快的遷移時間；分離體系的pH值對分離度及柱效有很大影響，要根據樣品蛋白質的性質選擇合適的pH值。

緩沖溶液中通過添加篩分介質，運行緩沖溶液的粘度變大，需要增長進樣前緩沖液沖洗平衡毛細管的時間。通過進樣后的加壓分析研究，發現分離結果并未得到實質改善，原因尚未明確，需要進一步實驗驗證；添加適當比例的有機溶劑如甲醇，可以減小溶液粘度，降低焦耳熱，從而改善峰形，添加比例增大時，峰形變差，遷移時間延長。

3 結束語

毛細管電泳分離蛋白質具有其高效、快速、樣品量少、溶劑量少等特點，但對于實際蛋白質研究還存在一些問題，如吸附問題、分辨率問題、復雜組分的干擾等。各種新的分離模式和探索正在進行中。毛細管電泳無膠篩分蛋白質的研究目前在國內外的報道還不太多，而篩分機理還不明確，因此進一步的研究十分有意義。目前的研究主要是在篩分介質的選擇和分離條件上的改進，建立更多的分離模式，使其具有實用性，并用于蛋白質和蛋白質組學研究有著廣闊的發展前景。

參考文獻

[1]丁文靜，許旭.基于纖維素衍生物的毛細管無膠篩分電泳及其應用[J].分析科學學報，2004，20（2）：204-209.

[2]周欣.高分子材料在無膠篩分毛細管電泳中的應用[J].醫學綜述，2006，12（7）：437-438.

[3]郭栩，余勝兵.毛細管無膠篩分電泳涂漬柱的制備和性能考察[J].分析化學，1996，24（7）：853-857.

[4]李克，袁倚盛.高效毛細管區帶電泳法分離人血清蛋白質的研究[J].色譜，2000，18 （2）：152-154.

[5]張振中，吳逸明.無膠篩分毛細管電泳在蛋白質分離中的應用[J].河南醫科大學學報，2000，35（3）：230-232.，

[6]趙京山，溫進坤.無膠篩分毛細管電泳檢測微量蛋白質方法的建立與評價[J].河北醫科大學學報，2005，26（2）：27-128.endprint