響應面分析法優化金蟬花多糖的提取工藝

王吉標，歐陽臻*，趙 明，2，尚 磊，王 璠，汪 愿，楊婧驊

1江蘇大學藥學院;2江蘇大學附屬醫院;3江蘇大學京江學院，鎮江212013

金蟬花為麥角菌科真菌大蟬草(Cordyceps cicadae Shing)及其寄主山蟬(Cicada flammata Dist)若蟲形成的干燥復合體，其性味甘寒，具散風熱，定驚鎮痙作用［1］。與冬蟲夏草的無性型同屬，具有調節免疫功能和脂類代謝，提升機體的營養狀況和抗疲勞抗應激、解熱鎮痛、滋補強壯等作用［1］。金蟬花主要含有多糖、腺苷、蟲草酸、氨基酸、多球殼菌素、麥角甾醇等多種化學成分［2］。現代藥理研究表明，金蟬花多糖為其主要活性成分之一，具有明顯的免疫調節［3］、改善腎功能［4］、抗腫瘤［5］等藥理活性，具有廣泛的研究價值和應用前景。但目前對優化金蟬花多糖提取工藝的研究較少，本實驗采用響應面分析法［6］考察關鍵工藝參數對金蟬花多糖得率的影響，優化其提取工藝，以期為金蟬花資源的深入開發利用提供實驗依據。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

野生金蟬花，采自句容市天王鎮磨盤山，由江蘇大學藥學院歐陽臻教授鑒定;石油醚、乙醇、濃硫酸、苯酚和葡萄糖均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司;高純水(實驗室自制)。

1．2 儀器與設備

SHB-111循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司;HHS-1恒溫水浴鍋，上海浦東躍新科學儀器廠;MP502B電子天平，上海精密科學儀器有限公司;1810-B型自動雙重純水蒸餾器，上海申立玻璃儀器公司;DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海恒科學儀器有限公司;UV-2102PCS型紫外可見分光光度計，上海尤尼柯分析儀器有限公司。

1．3 方法

1．3．1 金蟬花多糖提取與含量測定［7］

取干燥的金蟬花100．0 g，經高速粉碎機粉碎，過80目篩后，置于1000 mL圓底燒瓶中，加入600 mL石油醚回流提取2次，每次2 h，揮干石油醚后，在干燥箱中40℃烘干，得脫脂后的金蟬花干燥粉末，備用。精密稱取脫脂后的金蟬花干燥粉末1．0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，按照一定的料液比、提取溫度、提取時間、提取次數進行回流提取，趁熱抽濾，用少量熱水洗滌濾器，合并濾液與洗液，放冷，移至250 mL量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。根據苯酚-硫酸法測定吸光度，計算金蟬花多糖含量，按以下公式計算金蟬花多糖得率。

金蟬花多糖得率(%)=(多糖質量/藥材質量)×100%

1．3．2 標準曲線的繪制

準確稱取干燥至恒重的葡萄糖對照品114．6 mg，將其定容至100 mL容量瓶中，得到1．146 mg/mL 的儲備液。精密量取 1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6.0 mL置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容，吸取上述溶液各2．0 mL，加入5%苯酚溶液1．0 mL搖勻，迅速加入濃硫酸5．0 mL，搖勻，放置5 min，水浴加熱15 min，冷卻至室溫，用2 mL純水同法操作做空白，于490 nm處測定吸光度。以對照品溶液濃度為橫坐標x，吸光度測定值為縱坐標 y，繪制標準曲線。用最小二乘法計算得到回歸方程為y=0.0134x+0．0111，r=0．9996。在 11．46 ～ 68．76 μg/mL之間葡萄糖對照品濃度與吸光度呈良好的線性關系。

1．3．3 單因素試驗設計

1．3．3．1 提取溫度的選擇。

以金蟬花多糖得率為指標，在固定提取時間60 min，料液比1∶20，提取次數2次的條件下，考察不同提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)的提取效果。以得率為縱坐標，提取溫度為橫坐標作圖。

1．3．3．2 提取時間的選擇。

以金蟬花多糖得率為指標，在固定提取溫度90℃，料液比1∶20，提取次數2次的條件下，考察不同提取時間(30、60、90、120、150 min)的提取效果。以得率為縱坐標，提取時間為橫坐標作圖。

1．3．3．3 料液比的選擇。

以金蟬花多糖得率為指標，在固定提取溫度90℃，提取時間90 min，提取次數2次的條件下，考察不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)的提取效果。以得率為縱坐標，料液比為橫坐標作圖。

1．3．3．4 提取次數的選擇。

以金蟬花多糖得率為指標，在固定提取溫度90℃，提取時間90 min，料液比1∶20的條件下，考察不同的提取次數(1、2、3、4次)的提取效果。以得率為縱坐標，提取次數為橫坐標作圖。

1．3．4 響應面試驗設計

依據單因素試驗結果確定因素水平范圍，利用Design-Expert Software 8．0．6為輔助手段設計響應面試驗。根據中心組合設計原理，以提取溫度、提取時間、料液比3個因素為自變量，多糖的得率為響應值，設計了3因素3水平共17個試驗點的響應面分析試驗，其中12個為析因試驗，5個為中心試驗，其因素水平分析選取見表1。

表1 響應面因素水平編碼Table 1 Factors and levels of response surfacemethodology

2 結果與分析

2．1 單因素實驗結果

2．1．1 提取溫度對多糖得率的影響。

由圖1可知，隨著提取溫度的升高，金蟬花多糖的得率逐漸增大，但提取溫度超過90℃后，多糖得率反而略顯下降，這可能是因為溫度的升高導致多糖部分水解，使其得率有所下降。因此選擇溫度為90℃左右為宜。

圖1 提取溫度對多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the extraction yield of polysaccharides

2．1．2 提取時間對多糖得率的影響。

由圖2可知，在90 min之前，隨著提取時間延長，多糖得率逐漸上升，超過90min，多糖得率緩慢下降。這可能是隨著提取時間的延長，其它成分也同時被提取出，這也會影響到金蟬花多糖的得率。因此選擇提取時間為90 min左右較適宜。

圖2 提取時間對多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction duration on the extraction yield of polysaccharides

2．1．3 料液比對多糖得率的影響。

由圖3可知，隨料液比的增加，多糖得率逐漸增加，當料液比為1∶20時出現了峰值，隨后就趨于平緩，并伴有下降趨勢。這可能是因為金蟬花多糖幾乎被全部溶出后，過多加水增大了其他雜質的大量溶出，還會使濃縮過程中多糖損失增大，從而導致金蟬花多糖得率有所降低。因此選擇料液比1∶20為宜。

2．1．4 提取次數對多糖得率的影響。

由圖4可知，隨著提取次數的增加，多糖得率逐漸增加。提取2次后，金蟬花多糖得率不再明顯增加，這說明提取2次后，金蟬花多糖已經基本提取完全。提取次數越多，有效成分得率就越高，但是相對成本提高，綜合考慮選擇提取次數為2次比較合適。

圖3 料液比對多糖得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of polysaccharides

圖4 提取次數對多糖得率的影響Fig.4 Effect of times of extraction on extraction yield of polysaccharides

2．2 響應面試驗設計結果

2．2．1 建立模型方程與顯著性檢驗。

按照“1．3．4”進行響應面分析試驗，方案與結果見表2。用Design-Expert(8．0．6版本)軟件對表2中的數歸擬合得提取溫度(A)、提取時間(B)、料液比(C)與金蟬花多糖之間的二次多項回歸方程:Y=6．80-0．11A+0．061B+0．31C-0．065AB+0.10AC-0．048BC-0．75A2-0．23B2-0．48C2。

表2 響應面分析試驗結果Table 2 Design and results of response surfacemethodology test

12 0 -1 1 6．33 13 0 0 0 6．78 14 -1 0 1 5．89 15 0 1 -1 5．95 16 0 0 0 6．74 17 -1 0 -1 5．44

表3 方差分析結果Table 3 Analysis of variance(ANOVA)of the regressionmodel

表4 回歸方程可信度分析Table 4 Creditability analysis of regression equations

對上述回歸模型進行顯著性檢驗，表3方差分析結果可知，一次項中，C(料液比)對多糖得率的線性效應極顯著(P＜0．001)，A(提取溫度)對多糖得率的線性效應高度顯著(P＜0．01)，B(提取時間)對多糖得率的線性效應顯著(P＜0．05)，二次項中，A2、B2、C2影響均極顯著(P ＜0．001)，AC 影響顯著(P ＜0．05)，AB 和 BC 影響不顯著(P ＞0．05)，表明各個影響因素與響應值不是簡單的線性關系。在該試驗設計范圍內，該模型顯著性檢測 P＜0.001，極顯著，模型的復相關系數為0．9933，說明該模型能解釋99．33% 響應值的變化，即該模型與實際試驗擬合良好，試驗誤差小，證明應用響應曲面法優化的提取工藝提取金蟬花多糖是可行的。同時，由F值的大小可以推斷，在所選擇的試驗范圍內，3個因素對多糖提取得率影響的排序為料液比(C)＞提取溫度(A)＞提取時間(B)。方差分析及回歸系數顯著性檢驗結果見表3，回歸方程可信度分析見表4。

2．2．2 響應曲面分析

根據回歸方程，作出響應面和等高線，考察擬合響應面的形狀，分析提取溫度、提取時間、料液比對金蟬花多糖提取得率的影響。各因素及其相互作用對相應值的影響可以通過各圖直觀反應出來。Design-Expert Software 8．0．6軟件處理后三維響應面和等高線圖見圖5～7。

圖5 提取溫度、提取時間的等高線和響應面圖Fig.5 Contour plot and response surface plot for interactive effect of extraction temperature and extraction time on extraction yield of polysaccharides

圖6 提取時間、料液比的等高線和響應面圖Fig.6 Contour plot and response surface plot for interactive effect of extraction time and solid-liquid ratio on extraction yield of polysaccharides

圖7 提取溫度、料液比的等高線和響應面圖Fig.7 Contour plot and response surface plot for interactive effectofextraction temperature and solid-liquid ratio on extraction yield of polysaccharides

從響應面的最高點和等高線可以看出在所選的范圍內存在極值，響應面的最高點同時也是等值線中的最小橢圓的中心點。圖5～7表明，3因素對金蟬花多糖的提取都有顯著的影響，料液比的影響最為顯著，隨加水量的增加，多糖得率隨之增大，表現為曲面陡峭;提取溫度的影響相對顯著，表現為曲面相對較陡峭;提取時間的影響次之，表現為曲面較平緩，且隨其數值的增加或減少，響應值變化較小。從圖5、6可以看出，A與B、B與C交互作用并不顯著，它們對Y值的影響規律并不會隨著另一因素的改變而有明顯變化。圖7表明A、C交互作用顯著，在所選范圍內，A取不同的編碼值C對Y的影響表現出不同的規律;同樣，C取不同的編碼值時A對Y的影響規律也呈一定的變化趨勢。3個因素對Y值的影響以及各因素之間的交互影響與表3方差分析結果一致。

2．2．3 最優條件的確定

根據所得到的模型，可預測在穩定狀態下的最大響應值為Y=6．858%，對響應面結果利用軟件進行優化分析，以多糖得率為評價指標，得到金蟬花多糖相應的提取工藝優化條件為:提取溫度88．43℃，料液比 1∶23．15，提取時間 96．29 min。為檢驗響應面分析法所得結果的可靠性，采用上述優化條件進行金蟬花多糖的提取試驗，考慮到實際情況，將修正后的最佳提取條件定為提取溫度A=88℃，提取時間B=97 min，料液比C=1∶23，提取2次，共進行3次平行試驗，得到金蟬花多糖平均得率為6．787%(RSD=0．97%)，與理論預測值 6．858% 的相對誤差為-0．96%。此結果與預測值接近，說明此模型可靠，適用于金蟬花多糖提取工藝的優化。

3 結論

本實驗采用單因素試驗和響應面分析法優化金蟬花多糖的最佳提取工藝為提取溫度A=88℃，提取時間B=97 min，料液比 C=1∶23，提取2次，此條件下金蟬花多糖平均提取得率為6．787%。回歸分析和驗證試驗結果表明，模型可較好地預測金蟬花多糖得率，從而也說明了采用響應面分析法對金蟬花多糖提取條件優化合理可行，具有實際應用價值。

1 Wang CL(王春雷)，Lu BZ(蘆柏震)，Hou GL(侯桂蘭)．The research progress of Chinese Cordyceps cicadae．Chin Pharm J(中國藥學雜志)，2006，41:244-247．

2 Xu HJ(徐紅娟)，Mo ZH(莫志宏)，Yu JW(余佳文)，et al．Research progress on active ingredients of Cordyceps cicadae．China Pharm(中國藥業)，2009，18(4):19-20．

3 Jin LQ(金麗琴)，Lv JX(呂建新)，Yang JZ(楊介鉆)，et al．The active effects of PCPS on the immune inhibition of macrophage in rats．C hin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2007，38:1217-1220．

4 Jin ZH(金周慧)，Chen YP(陳以平)．The Mechanism study of cordyceps soboliferamycelium preventing the progression of glomerulosclerosis．Chin JChin-west Nephropath(中國中西醫結合腎病雜志)，2005，6:132-136．

5 Chen PK(陳柏坤)，Yang JZ(楊介鉆)，Zhuo J(卓佳)．The modulating effects of PCPS on proliferative activity ofmononuclear cell and leukemic cell line U937 and K562 in human peripheral blood．JWenzhou Med Coll(溫州醫學院學報)，2006，36:341-344．

6 He YF(何彥峰)，Yang RM(楊仁明)，Hu N(胡娜)，et al．Optimization of extraction process of polysaccharides from Fenugreek by response surface methodology．Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發)，2012，24:1463-1467．

7 China Pharmacopoeia Committee(國家藥典委員會)．Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中華人民共和國藥典)．Beijing:Chemistry Industry Press，2010．Vol I，232-233．