響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取毛花獼猴桃根中三萜類化合物的工藝研究

林水花，吳建國，鄭燕枝，吳巖斌，鄒秀紅，吳錦忠*

1福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院;2福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州350108;3福建省永春縣林業(yè)局，永春362600

毛花獼猴桃(Actinidia eriantha Benth．)，又名白毛桃、毛冬瓜、白藤梨，其根、根皮和葉均可入藥，主要分布在浙江、江西、福建、湖南等地，資源豐富。民間用其根治療肺熱失音，大頭瘟，濕熱帶下，乳癰，胃癌，鼻癌，乳癌等［1］。研究表明毛花獼猴桃根主要含有三萜類等化學(xué)成分［2，3］，具有廣泛的生物活性如抗炎、抗腫瘤等［4］，三萜類化合物的抗腫瘤作用機制也多種多樣，如抑制腫瘤細胞的增殖，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤血管生成，抑制腫瘤細胞端粒酶活性等［5］。

超聲提取方法是一種新技術(shù)，具有低溫、高效、能夠節(jié)省溶劑等優(yōu)點，有利于提取不受熱和不穩(wěn)定的成分［6］。本文采用超聲輔助提取的方法，根據(jù)單因素考察結(jié)果結(jié)合響應(yīng)面分析法對毛花獼猴桃根中的總?cè)铺崛」に囘M行優(yōu)化，為毛花獼猴桃根的進一步開發(fā)與研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 藥材與試劑

毛花獼猴桃根采自福建永春藥材市場，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊成梓副教授鑒定為獼猴桃科植物毛花獼猴桃(Actinidia eriantha Benth．)的根。乙醇、高氯酸(天津福晨化學(xué)試劑廠)和香草醛、冰乙酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)均為分析純;熊果酸標準品購自中國藥品生物制品檢定所(批號:110742-200517)。

1．2 儀器與設(shè)備

LK-1000A搖擺式中藥粉碎機(上海隆拓儀器設(shè)備有限公司);SFG-02B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司);AB204-N電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);KQ-500E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DLSD-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);HH-S型水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);UV-1800紫外可見分光光度計(日本島津儀器有限公司)。

1．3 實驗方法

1．3．1 標準曲線繪制

精密稱取熊果酸標準品2．5 mg于10 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶液溶解并定容至刻度，搖均，配置成含熊果酸0．25 mg/mL的對照品溶液。分別精密量取對照品溶液 0．2、0．3、0．4、0．5、0．6、0．7 mL置于10 mL容量瓶中，水浴加熱，除去溶劑后加入0．5 mL 5%香草醛-冰乙酸及1．2 mL高氯酸，混勻，密塞，置70℃恒溫水浴加熱15 min，取出冰浴冷卻至室溫，乙酸乙酯定容，搖均。以相應(yīng)試劑溶液為空白對照，于550 nm測定吸光值，以吸光度為眾坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線得 Y=0．07465X+0.02193，R2=0．99995。結(jié)果表明，三萜酸在濃度為5．0μg/mL至17．5μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

1．3．2 樣品制備及含量測定

準確稱取毛花獼猴桃根粉末10．0 g，乙醇超聲提取，回收溶劑，提取液在水浴鍋上干燥至恒重。精密稱取干燥至恒重提取物10 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，提取物溶液濃度為0．4 mg/mL。按標準曲線繪制方法進行三萜酸含量測定，計算毛花獼猴桃根中總?cè)频暮?mg/g)。

1．3．3 方法學(xué)考察

1．3．3．1 精密度實驗

分別精密量取熊果酸對照品溶液0．3 mL及提取物溶液1 mL，于10 mL容量瓶中。按2．6方法測定總?cè)坪浚謩e連續(xù)測量6次。總?cè)坪康腞SD分別為1．80%和1．90%，表明儀器精密度良好。

1．3．3．2 穩(wěn)定性實驗

分別精密量取熊果酸對照品溶液0．3 mL和提取物溶液1 mL，于10 mL容量瓶中。按1．3．1方法操作，分別于 0、15、30、45、60、75、90 min 測定吸光度值。總?cè)坪康?RSD分別為 1．37%和1.38%，表明樣品在90 min內(nèi)穩(wěn)定。

1．3．3．3 重復(fù)性實驗

精密稱取藥材粉末2 g，共6份，分別加入30 mL 75%的乙醇溶液，浸泡20 min，超聲提取45min，提取功率500 W。提取兩次，過濾，合并提取液，再按1．3．1項下操作，測定吸光度值。總?cè)坪康腞SD為3．29%，表明方法重復(fù)性好。

1．3．3．4 加樣回收率實驗

精密稱取同一批藥材粉末6份，每份0．5 g，分別加入熊果酸對照品4．0mg，7．5 mL 75%的乙醇溶液，浸泡20 min，超聲提取45 min，提取溫度40℃，提取功率500 W。提取兩次，過濾，合并提取液，按1．3．1項下操作，測定吸光度值。總?cè)坪康腞SD為4．27%，表明方法準確度良好。

1．3．4 超聲波輔助提取三萜類化合物的單因素實驗

1．3．4．1 乙醇濃度考察

精密稱取藥材粉末10．0 g，共5份，分別加入150 mL乙醇溶液，乙醇濃度分別為 15%、35%、55%、75%、95%。浸泡20 min，超聲提取45 min，提取功率為500 W。提取兩次，提取液過濾，合并濾液，濃縮，水浴鍋蒸干，得到樣品提取物。

1．3．4．2 料液比考察

分別精密稱取粉末10．0 g，共5份，分別加入100、150、200、250、300 mL 75% 的乙醇溶液。浸泡20 min，超聲提取45 min，提取功率500 W。提取兩次，提取液過濾，合并濃縮，水浴鍋蒸干，得到樣品提取物。

1．3．4．3 提取功率考察

精密稱取藥材粉末10 g，共5份，分別加入150 mL 75%的乙醇溶液。浸泡20 min，超聲提取45 min，提取功率分別為 120、200、300、400、500 W。提取兩次，提取液過濾，合并濃縮，水浴鍋蒸干，得到樣品提取物。

1．3．4．4 提取時間考察

精密稱取藥材粉末10 g，共5份，每份分別加入150 mL 75%乙醇溶液。浸泡20 min，分別超聲提取15、30、45、60、75 min，提取功率為 500 W。提取兩次，提取液過濾，合并濃縮，水浴鍋蒸干，得到樣品提取物。

1．3．5 響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波輔助提取三萜類化合物的工藝參數(shù)

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，確定總?cè)频挠绊懸蛩兀謩e為乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取功率(D)，選取總?cè)频寐瘦^高的三組數(shù)據(jù)，運用Design-Expert8．05軟件程序根據(jù) Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法，以總?cè)频奶崛〉寐蕿轫憫?yīng)值作響應(yīng)面，對提取條件進行優(yōu)化。因素與水平的實驗設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面分析因素和水平Table 1 Factors and levels of RSA

2 結(jié)果與分析

2．1 單因素考察實驗結(jié)果

乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲波功率、提取時間對三萜類化合物提取率的影響見圖1。

圖1 料液比(A)、乙醇濃度(B)、超聲功率(C)及提取時間(D)對總?cè)铺崛〉挠绊慒ig.1 Effect ofmaterial-solvent ratio(A)，ethanol concentration(B)，ultrasonic power(C)and extraction time(D)on extraction yield of triterpenoid

2．2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化

2．2．1 響應(yīng)面分析因素水平的選擇

根據(jù)Box-behnken中心組合實驗設(shè)計原理，綜合單因素實驗結(jié)果，選取乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲波功率和提取處理時間進行4因素3水平實驗設(shè)計，利用Design-Expert軟件進行數(shù)據(jù)擬合，實驗因素和水平見表1。

以乙醇體積分數(shù)(A)、料液比(B)、提取時(C)和間超聲波功率(D)為自變量，三萜類化合物的提取率(Y)為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析實驗，實驗方案及實驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果Table 2 Design and experimental results of RSA

3 0-1 1 0 9．091 9．594 4 1 0 0-1 11．554 11．727 5 0 0-1 1 11．507 11．261 6 0 0 0 0 10．302 11．369 7 0 0 0 0 11．787 11．369 8 1 1 0 0 12．615 12．196 9 0 1 0 1 12．639 12．728 10 0 0 1 -1 10．43 10．159 11 0 0 1 1 12．46 11．956 12 -1 0 -1 0 7．743 8．005 13 1 0 0 1 12．55 12．809 14 -1 0 1 0 9．381 9．077 15 0 1 1 0 10．17 10．955 16 -1 0 0 -1 8．574 8．779 17 0 0 0 0 11．787 11．369 18 -1 1 0 0 9．767 9．410 19 0 1 -1 0 10．705 10．665 20 -1 -1 0 0 8．295 8．197 21 0 0 0 0 12．535 11．369 22 1 -1 0 0 10．934 10．774 23 0 -1 -1 0 9．713 9．391 24 0 -1 0 -1 10．097 10．062 25 0 0 0 0 10．435 11．369 26 1 0 1 0 11．142 10．933 27 -1 0 0 1 10．103 10．394 28 0 1 0 -1 11．043 10．985 29 0 0 -1 -1 10．374 10．361

2．2．2 模型的建立及其顯著性檢驗

Design-Expert軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合得到三萜得率對乙醇濃度、料液比、提取時間、提取功率的二次多項回歸模型:

Y=-10．63+0．35 × A+0．54 × B+0．33 × C-0.02×D+5．225×10-4×A ×B-1．375×10-3×A ×C-6．66×10-5×A ×D+2．9×10-4×B ×C+3．95×10-4×B ×D+1．50×10-4×C ×D-1．87×10-3×A2-0．02×B2-3．29×10-3×C2+3．05×105×D2

Y為總?cè)坪浚珹、B、C、D分別為乙醇濃度、料液比、提取時間、提取功率。總?cè)坪康念A(yù)測響應(yīng)值可從二次多項式方程中的自變量值中獲得。對上述回歸模型進行顯著性檢驗，結(jié)果見表3。

表3 總?cè)铺崛÷实姆讲罘治霰鞹able 3 AVONA of extraction of triterpenoid from A．eriantha

AC 0．680 1 0．681 1．588 0．2283 AD 0．071 1 0．071 0．166 0．6902 BC 0．002 1 0．002 0．004 0．9480 BD 0．156 1 0．156 0．363 0．5565 CD 0．201 1 0．201 0．469 0．5045 A2 3．624 1 3．624 8．453 0．0115 B2 1．478 1 1．478 3．447 0．0845 C2 3．554 1 3．554 8．290 0．0121 D2 0．605 1 0．605 1．411 0．2546 Model 42．292 14 3．021 7．046 0．0004 Residual 6．002 10 0．429 Lack of fit 2．282 4 0．228 0．245 0．9674 Pure error 3．720 28 0．930 Cor total 48．294 R2=0．876 R2 Adj=0．751 CV=6．129 Adeq precision=10．200

從表3分析可知，該模型 F值等于7．046且“Prob＞F”小于0．05說明擬合的模型高度顯著。失擬項是模型中數(shù)據(jù)的變異，失擬項的F值和P值分別為0．245和0．967，說明失擬項不顯著，該回歸方程無失擬因素存在，回歸模型與實測值能較好的擬合。R2Pre為0．607和 R2Adj為0．751均在合理的范圍內(nèi)，信噪比為10．200，表示該模型有足夠的信號。以上均說明該模型可用于優(yōu)化總?cè)铺崛」に囋O(shè)計。

2．2．3 響應(yīng)曲面分析

圖2 乙醇濃度(A)和料液比(B)對總?cè)铺崛∮绊懙捻憫?yīng)面和等高線圖Fig.2 Response surface plot and contour plot showing the effect of A and B on extraction yield of triterpenoid

圖3 乙醇濃度(A)和提取時間(C)對總?cè)铺崛∮绊懙捻憫?yīng)面和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot showing the effect of A and C on extraction yield of triterpenoid

圖4 乙醇濃度(A)和提取功率(D)對總?cè)铺崛∮绊懙捻憫?yīng)面和等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot showing the effect of A and D on extraction yield of triterpenoid

圖5 料液比(B)和提取時間(C)對總?cè)铺崛∮绊懙捻憫?yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot showing the effect of B and C on extraction yield of triterpenoid

圖6 料液比(B)和提取功率(D)對總?cè)铺崛∮绊懙捻憫?yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot showing the effect of B and D on extraction yield of triterpenoid

圖7 提取時間(C)和超聲功率(D)對總?cè)铺崛∮绊懙捻憫?yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot showing the effect of C and D on extraction yield of triterpenoid

根據(jù)回歸方程，做出的響應(yīng)面和等高線圖，是特定的響應(yīng)面Y(總?cè)频奶崛÷?對應(yīng)的因素A、B、C、D構(gòu)成的一個三維空間在二維平面上的等高圖，可直觀反映各因素對響應(yīng)值的影響。等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。

2．3 總?cè)频淖顑?yōu)工藝條件與驗證

Design-Expert軟件分析處理，結(jié)果表明，從毛花獼猴桃根中超聲提取總?cè)频淖顑?yōu)條件為:乙醇濃度71．72%，料液比 1∶20(g/mL)，提取時間 45．24 min，提取功率400 W。總?cè)频暮?3．26 mg/g。考慮到實際操作條件，將毛花獼猴桃根三萜提取的最佳工藝調(diào)整為:乙醇濃度72%，料液比1∶20(g/mL)，提取時間45 min，提取功率400 W。依據(jù)調(diào)整后的條件進行驗證實驗，重復(fù)三次，得到總?cè)坪科骄禐?2．65 mg/g，實際值與理論預(yù)測值的相對誤差為4．60%，實際值與理論值非常接近，說明該方程與實際情況擬合良好。

3 討論

近年來，超聲波輔助提取結(jié)合響應(yīng)面分析法在優(yōu)化黃酮［7］、三萜［8］、皂苷［6］、多糖［9］、多酚［10］等天然有效成分的提取工藝中得到了廣泛應(yīng)用。與傳統(tǒng)的正交設(shè)計實驗相比，響應(yīng)面分析法能夠更好地反映多種實驗因素間的交互作用，并在給出的區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的回歸方程，進行精確回歸分析，從而優(yōu)選到最佳的考察因素值。

毛花獼猴桃根中總?cè)频奶崛」に囇芯窟€未見報道，因此本實驗采用超聲波輔助提取的方法結(jié)合響應(yīng)面分析首次對毛花獼猴桃根中的總?cè)瞥曁崛l件進行了優(yōu)化考察，實驗結(jié)果顯示，乙醇濃度對總?cè)频某曁崛∮绊憳O其顯著，料液比和超聲功率對總?cè)铺崛〉挠绊懸卜浅ｏ@著。實驗結(jié)果得到的回歸模型顯著，失擬誤差不顯著，說明通過本實驗所建立的二次回歸方程能較好的描述各因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系，該模型顯著可靠，較好的優(yōu)化了從毛花獼猴桃根中提取總?cè)频墓に嚕玫降淖罴烟崛l件為乙醇濃度72%，料液比1∶20 g/mL，超聲波功率400W，提取時間45 min。該方法不但操作簡單，耗時短，提取效率高，而且在較低溫條件下進行，避免了對提取物有效成分的破壞，因此，可廣泛應(yīng)用于毛花獼猴桃根中總?cè)频奶崛　?/p>

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