多花黃精多糖的分級(jí)提取及結(jié)構(gòu)初步分析

王 坤，岳永德，湯 鋒，荀 航，孫 嘏，王 進(jìn)

國(guó)際竹藤中心，北京100102

黃精始載于《明醫(yī)別錄》，是中國(guó)傳統(tǒng)中草藥。為百合科黃精屬(Liliaceae)多年生草本植物，有黃精(Polygonatum sibiricum Red．)、滇黃精(Polygonatum kingianum Coll．et Hemsl．)和多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua．)等，其中以多花黃精的質(zhì)量最佳、藥效最好［1］。黃精多糖是黃精化學(xué)組成的一個(gè)重要部分，含量可以達(dá)到17．79%［2］，是黃精的主要生物活性成分之一，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，黃精多糖具有抗衰老、抗腫瘤［3］、降血糖［4］、降血脂、防動(dòng)脈硬化、抗病毒［5］、抗菌［6］、提高機(jī)體免疫力等多種藥理作用。關(guān)于黃精多糖的組成、種類及分子量等理化性質(zhì)則因黃精的品種和產(chǎn)地而有明顯差異，張曉紅等［7］報(bào)道內(nèi)蒙古野生黃精多糖是由單一果糖組成的相對(duì)分子量為7073 Da的同多糖;吳群絨等［8］報(bào)道滇黃精多糖I主要是由葡萄糖組成的相對(duì)分子量為8100 Da的中性雜多糖，以α-(1，4)糖苷鍵鏈接。這些研究?jī)H對(duì)黃精多糖的種類和結(jié)構(gòu)做了初步探索。

另外，黃精多糖的提取分離工藝、含量測(cè)定及其藥理作用方面國(guó)內(nèi)外已有大量研究報(bào)道，但關(guān)于黃精多糖的組成和結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道甚少。本文采用多種現(xiàn)代儀器分析測(cè)試手段如離子色譜儀、紅外光譜分析儀、凝膠色譜分析儀、核磁共振波譜儀、熱重分析儀等，對(duì)黃精多糖的組成及含量進(jìn)行表征，著重研究比較不同提取條件下黃精多糖的分離及結(jié)構(gòu)特性，包括單糖組成、分子量及其分布和熱穩(wěn)定性等理化性質(zhì)，為黃精多糖構(gòu)效關(guān)系的研究和功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供了新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

黃精原材料于2011年10月采于安徽省九華山，經(jīng)安徽省林科院胡一民研究員鑒定為百合科植物多花黃精(Polygonatum cyrtonema Hua．)。經(jīng)洗凈烘干，切片，用植物粉碎機(jī)粉碎成約20目，密封于磨口瓶于-10℃冷凍保存，備用。

單糖標(biāo)準(zhǔn)品(L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、L-葡萄糖、L-半乳糖、D-甘露糖、D-木糖)購(gòu)買(mǎi)于美國(guó) Sigma公司;葡聚糖標(biāo)樣(分子量分別為 180、2500、4600、7100、21400、41100、133800 和 2000000);其它試劑均為分析純。

1．2 儀器與設(shè)備

BP-221S電子天平(d=0．1 mg)，德國(guó) Sartorius公司;EYELAN-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本 EYELA公司;DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;恒溫水浴鍋，北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司;PURELAB Plus型超純水系統(tǒng)，美國(guó) PALLGELMAN公司;IKA ETS-D5加熱型磁力攪拌器，德國(guó)IKA公司;LABCONCO Free Zone冷凍干燥儀，美國(guó)LABCONCO公司;Nexus傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Nicolet公司;Q500熱重分析儀，美國(guó)TA公司;ICS3000離子色譜儀，美國(guó)Dionex公司;Bruker AV300核磁共振波譜儀，德國(guó)Bruker公司。

1．3 方法

1．3．1 分級(jí)提取

取多花黃精粉，用石油醚于80℃回流脫脂24 h，回收石油醚，藥渣揮干溶劑;取去脂黃精粉30 g，第一步:加入600 mL的蒸餾水80℃提取4 h，過(guò)濾得濾液，濃縮至原體積的1/6，然后用4倍體積的乙醇醇沉，靜置24 h后離心得沉淀，冷凍干燥得多花黃精多糖樣品PCP1;第二步:取第一步中的濾渣，加入0．1%NaOH溶液80℃提取4 h(料液比1∶20，g∶v)，過(guò)濾得濾液，濃縮至原體積的1/6，用2 M的HCl調(diào)節(jié)至中性，然后用4倍無(wú)水乙醇醇沉，靜置24 h后離心得沉淀，冷凍干燥得PCP2;第三、四、五步同二步，分別采用上一步的濾渣，用0．5%、1．0%、2．0%的NaOH溶液提取(料液比1∶20)，得多花黃精多糖樣品 PCP3、PCP4、PCP5。

1．3．2 單糖組成分析

黃精多糖的單糖含量采用一步酸水解法分析其相應(yīng)的水解產(chǎn)物含量來(lái)確定［9］。稱取黃精多糖樣品5 mg，加入0．125 mL 72%的硫酸，在室溫條件下不斷振動(dòng)，然后加入1．35 mL蒸餾水，稀釋為1．475 mL，然后放入121℃烘箱中，加熱2．5 h，半小時(shí)晃動(dòng)一次。冷卻后，用0．22μm親水性濾膜過(guò)濾，除去不溶物。將濾液稀釋50倍后，進(jìn)高效離子色譜(HPIC)測(cè)定單糖組成。高效離子色譜儀配備脈沖安培檢測(cè)器(PAD)及糖分析專用離子交換分析柱(CarboPacTM PA1，i．d．4 mm × 250 mm，5 μm)。具體分析條件如下:淋洗液濃度為18 mM NaOH，并柱后加堿0．3 M NaOH，流速設(shè)為 0．5 mL/min，時(shí)間為45 min;然后用0．2 M NaOH洗色譜柱10 min，最后用18 mM NaOH平衡10 min。酸性單糖采用0．4 M NaOH的流動(dòng)相，流速設(shè)為1．0 mL/min分析10 min。采用保留時(shí)間定性，外標(biāo)法計(jì)算糖含量。

1．3．3 多糖分子量測(cè)定

黃精多糖的分子量測(cè)定采用凝膠色譜法(GPC)法［10］。具體分析條件如下:Aquagel-OH(美國(guó)Agilent，i．d．7．5 mm ×300 mm，8 μm)色譜柱，示差檢測(cè)器(RID)，淋洗液為含有0．02 M NaCl的5 mM磷酸鈉緩沖液，pH 值為7．5，流速為 0．1 mL/min，樣品濃度為0．1%。以已知分子量的多糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間做標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算多糖樣品的分子量水平。

1．3．4 紅外光譜分析

將黃精多糖樣品以1∶100比例同溴化鉀混合后，在瑪瑙研缽中磨至約200目粉末，在紅外壓片機(jī)上制成透明薄片，采用紅外光譜儀配備DTGS(氘化硫三肽)熱電檢測(cè)器分析。掃描波長(zhǎng)范圍為4000～400 cm-1，共掃描64次，分辨率為2 cm-1。以純溴化鉀得到的紅外光譜圖作為背景。

1．3．5 核磁共振波譜分析

黃精多糖樣品用重水(D2O)溶解后在核磁共振儀上進(jìn)行1H NMR和13C NMR分析，以四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標(biāo)物。核磁條件為氫譜(1H NMR):脈沖程序(PULPROG):zg;馳豫延遲(D1):2．00000000 sec;采樣通道1H 高功率 90°脈寬(P1):4．00 usec。碳譜(13C NMR):脈沖程序(PULPROG):zgdc;馳豫延遲(D1):2．00000000 sec;采樣通道1H高功率90°脈寬(P1):3．00 usec。

1．3．6 熱重分析

黃精多糖樣品的熱重(TGA)分析采用同步熱分析儀測(cè)定。將15 mg樣品置于鋁坩鍋中，在氮?dú)獾沫h(huán)境下，以10℃/min的加熱速度從室溫加熱到600℃，連續(xù)記錄樣品的質(zhì)量和放熱數(shù)據(jù)而獲得樣品的熱穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2．1 得率與單糖組成分析

通過(guò)熱水和進(jìn)一步NaOH溶液提取得到的五個(gè)多糖樣品分別命名為 PCP1、PCP2、PCP3、PCP4、PCP5。PCP1為白色粉末，堿提的樣品PCP2-5為黃褐色粉末。得率和糖分析的結(jié)果如表1，水提多糖的得率可以達(dá)到40．3%，進(jìn)一步加入堿液提取濾渣里面的多糖，當(dāng) NaOH溶液的濃度由0．1%升至0.5%時(shí)，樣品的得率從14．2%升高到20．1%，然后隨著NaOH溶液濃度的升高，樣品得率逐漸下降，當(dāng)用2．0%的 NaOH提取時(shí)，PSP5的得率最小，為6.4%。從表1可以看出，所有樣品都含有一定量的阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖醛酸，以及少量的木糖和葡萄糖醛酸，除了甘露糖之外，其他單糖和糖醛酸，在多花黃精的同屬植物黃精(P．sibiricum)中均有發(fā)現(xiàn)［11］。在單糖組成分析中，水提和堿提的多糖樣品呈現(xiàn)出了顯著的差異，通過(guò)進(jìn)一步的堿提，阿拉伯糖的相對(duì)含量由水提的2．1%增加到20%左右，葡萄糖醛酸的相對(duì)含量也由0．5%提高到了7%左右，半乳糖的相對(duì)含量也得到了明顯提高，可以達(dá)到總量的60%左右;而葡萄糖、甘露糖、半乳糖醛酸的相對(duì)含量降低了，在PCP4中，他們的相對(duì)含量降到了2．7%、6．7%、0．1%。堿提的樣品中，隨著堿液濃度的增加，葡萄糖和半乳糖醛酸的相對(duì)含量逐漸降低，而甘露糖和葡萄糖醛酸的相對(duì)含量卻在逐漸增加。

表1 多花黃精多糖得率(質(zhì)量百分比)及糖組成(相對(duì)百分比)測(cè)定結(jié)果Table 1 Yield(weight%)，sugar composition(relative weight%，w/w)of the five polysaccharides isolated from the rhizomes of P．cyrtonema

2．2 分子量及其分布

多糖樣品的分子量是由凝膠色譜儀在水相中測(cè)定的，所得到的重均分子量、數(shù)均分子量以及分散度系數(shù)值列于表2中。為了更直觀的描述樣品PCP1-5之間變化，分子量分布圖也示于圖1。從表2的數(shù)據(jù)可以看出，水提樣品PCP1的分子量明顯小于其他樣品，并且與PCP1的分子量分布方式不同的是，進(jìn)一步堿提得到的樣品具有更廣泛的分布范圍，分散系數(shù)較大。

表2 多花黃精多糖重均分子量、數(shù)均分子量和分散系數(shù)Table 2 Weight average(w)，number average(n)molecular weight and polydispersity(w/n)of the five polysaccharides isolated from the rhizomes of P．cyrtonema Hua

圖1 多花黃精多糖的分子量分布圖Fig.1 Molecular weight distribution curves of the five polysaccharides isolated from the rhizomes of P．cyrtonema Hua

2．3 紅外光譜分析

紅外光譜分析結(jié)果如圖2所示，用于提供更多的多糖結(jié)構(gòu)信息，在3415 cm-1處的強(qiáng)烈吸收峰是由于在氫鍵中OH的伸縮振動(dòng)引起的，它表明了多糖鏈中強(qiáng)有力的分子內(nèi)和分子間的相互作用。在2930 cm-1處的峰，是由于脂肪族CH2中非對(duì)稱和對(duì)稱的C-H鍵伸縮頻率引起的，并且它們是多糖的典型吸收峰［12］。以羧基為特征的糖醛酸可能會(huì)引起三個(gè)吸收峰［13］:1750 cm-1處的吸收峰是由于質(zhì)子化了的C=O鍵的伸縮振動(dòng)引起的，1620 cm-1和1420 cm-1處的峰是質(zhì)子化的羧酸COO-基團(tuán)的吸收峰，因此，PCP1～5都是含有糖醛酸的酸性多糖，同時(shí)在1620 cm-1附近的吸收峰，從PCP1到PCP5，它的吸收是逐漸加強(qiáng)的，在水提的樣品中主要含半乳糖醛酸，而進(jìn)一步堿提的樣品中含有相對(duì)較多的葡萄糖醛酸，這個(gè)結(jié)果與上述單糖組成分析的結(jié)果相符。1045 cm-1附近的強(qiáng)吸收峰證明，單糖是以吡喃糖苷的形式存在的。以上均為多糖的典型結(jié)構(gòu)，說(shuō)明多花黃精多糖水提的和進(jìn)一步堿提的樣品都是吡喃環(huán)酸性多糖。

圖2 多花黃精多糖的紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of the five polysaccharides isolated from the rhizomes of P．cyrtonema

2．4 核磁波譜分析

由于存在種類較多的連接單元，以致碳譜中的峰重疊現(xiàn)象比較明顯，無(wú)法精確地歸屬每種連接單元中C1～C6的化學(xué)位移。

PCP1的13C NMR圖譜(圖3)中 δ(ppm)104．042、δ103．873、δ103．740、δ103．279、δ103．177、δ92.228六個(gè)異頭碳C1的信號(hào)中，在δ103以上的有五個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，在δ103以下的只有一個(gè)弱吸收峰，說(shuō)明PCP1中的異頭碳構(gòu)型五種為β型，一種為 α 型［14］，說(shuō)明該糖含有六種糖殘基。δ81．169、δ80．287、δ76．882、δ74．495、δ72．517、δ62．348、δ60.599處的信號(hào)為糖上的其他碳信號(hào)。δ27．614和δ23．940處為CH3CON中CH3的共振信號(hào)。約δ18處未出現(xiàn)碳信號(hào)，說(shuō)明PCP1中沒(méi)有鼠李糖的存在，以上分析結(jié)果與單糖組成分析結(jié)果一致。δ20.355和 δ16．881為-CH3的共振訊號(hào)。PCP1的1H NMR圖譜(圖4)中C1上的質(zhì)子H1的強(qiáng)吸收峰在 δ4.582，還有一個(gè)非常弱的信號(hào)大于 δ5．0，說(shuō)明PCP1的異頭碳構(gòu)型主要是β型，有少量α型，這與13C NMR譜的結(jié)果吻合。其他氫的化學(xué)位移重疊在δ3．3～3．9區(qū)域內(nèi)，更精確的結(jié)構(gòu)尚待進(jìn)一步研究。

PCP3和 PCP5的13C NMR圖譜(圖 3)和1H NMR圖譜(圖4)比較相近。PCP3的13C NMR圖譜中 δ107．661、δ107．625、δ104．530、δ104．570 四個(gè)異頭碳C1的強(qiáng)吸收峰，和PCP5的13C NMR圖譜中δ107．574、δ104．460 兩個(gè)異頭碳 C1 的強(qiáng)吸收峰都在δ103以上，說(shuō)明PCP3和PCP5的異頭碳構(gòu)型為α型，PCP3含有四種糖殘基，而PCP5含有兩種糖殘基。糖上的其他碳信號(hào)重疊在 δ60-84區(qū)域內(nèi)。PCP3和PCP5的1H NMR圖譜中C1上的質(zhì)子H1的δ大于5．0，再次驗(yàn)證了PCP3和PCP5的構(gòu)型為α型，其他氫的化學(xué)位移重疊在δ3．3-3．9區(qū)域內(nèi)。

圖3 多花黃精多糖PCP1、PCP3和PCP5的13 C核磁共振波譜圖Fig.3 13 C NMR spectra of the polysaccharides PCP1，PCP3 and PCP5 isolated from the rhizomes of P．cyrtonema

2．5 熱穩(wěn)定性分析

多糖的實(shí)用性能不僅與他們的化學(xué)特性有關(guān)，在很大程度上還依賴于他們的熱學(xué)性能，熱分析試驗(yàn)可以測(cè)定多種熱學(xué)參數(shù)，幫助我們認(rèn)識(shí)和預(yù)測(cè)多糖的熱穩(wěn)定性能［15］。多糖樣品PCP1～PCP5的熱重分析TGA曲線如圖5，它記錄了多糖在加熱的過(guò)程中質(zhì)量的損失情況。多糖樣品PCP1～PCP5的TGA曲線都表明降解發(fā)生了四個(gè)階段:從室溫到115℃為降解的第一階段，大約有10%的質(zhì)量損失，主要是由于水分的流失;第二階段是大分子聚合物的降解，PCP1～PCP5的初始降解溫度分別為230、205、205、205和192℃，在此期間PCP1～PCP5的質(zhì)量損失大約為20%、30%、32%、30%和35%，;第三階段大約從300℃到500℃，當(dāng)溫度達(dá)到530℃時(shí)，PCP1～PCP5的質(zhì)量損失分別為55%、62%、63%、70%和75%;慢慢地隨著溫度的升高，多糖樣品就成為碳化結(jié)構(gòu)。

第二和第三階段的數(shù)據(jù)表明多花黃精多糖的降解主要發(fā)生在第二階段和第三階段，PSP5樣品從192℃就開(kāi)始降解，到243℃時(shí)質(zhì)量損失達(dá)到40%，相反PCP1樣品初始降解溫度在230℃，到第二階段降解完成，質(zhì)量損失了30%，PCP2、3、4的熱分析曲線相似，介于PCP1和PCP5之間，與進(jìn)一步堿提的樣品相比，水提樣品的初始降解溫度高，主鏈的斷裂溫度高，并且質(zhì)量損失率小，所以水提多糖的熱穩(wěn)定性明顯高于進(jìn)一步堿提的多糖，并且NaOH溶劑的濃度越高，提取得到的黃精多糖樣品熱穩(wěn)定性越差。結(jié)合分子量分布曲線圖(圖1)可以看出，進(jìn)一步堿提的樣品分散度非常高，分子鏈長(zhǎng)短分布不均勻不集中，影響了聚合物的穩(wěn)定性，這一結(jié)果與熱分析數(shù)據(jù)相一致。

3 結(jié)論

圖4 多花黃精多糖PCP1、PCP3和PCP5的1 H核磁共振波譜圖Fig.4 1 H NMR spectra of the polysaccharide PCP1，PCP3 and PCP5 isolated from the rhizomes of P．cyrtonema

圖5 多花黃精多糖的熱重分析曲線Fig.5 TGA curves of the five polysaccharides isolated from the rhizomes of P．cyrtonema

本文采用分級(jí)提取的方法，用熱水和進(jìn)一步堿液提取多花黃精，得到五種多糖樣品(PCP1、PCP2、PCP3、PCP4和PCP5)。單糖組成分析結(jié)果表明，水提和進(jìn)一步堿提得到的樣品在單糖相對(duì)含量上呈現(xiàn)出了顯著的差異，水提的樣品中，半乳糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖醛酸的相對(duì)含量較高;而進(jìn)一步堿提的樣品中，阿拉伯糖和半乳糖的相對(duì)含量得到了很大的提高，可以達(dá)到總量的80%，而葡萄糖、甘露糖和半乳糖醛酸的相對(duì)含量降低了。紅外光譜結(jié)果顯示多花黃精多糖是含有吡喃環(huán)的酸性多糖。

通過(guò)水提和進(jìn)一步堿提得到的五個(gè)樣品都含有一定量的糖醛酸，糖醛酸的存在可能是許多酸性多糖具有特征生理活性的重要原因之一［16］，這為多花黃精多糖進(jìn)一步進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系的研究提供了理論依據(jù)。

分子量和熱穩(wěn)定性分析表明，與水提的樣品相比，進(jìn)一步堿提得到的樣品分散度高，分子鏈長(zhǎng)短分布不均勻，熱穩(wěn)定性較差，并且提取時(shí)堿液濃度越高，熱穩(wěn)定性越差。核磁共振分析提供了更多的結(jié)構(gòu)信息，13C NMR進(jìn)一步表明PCP1的異頭碳構(gòu)型主要是β型，有少量α型，含有六種糖殘基，而進(jìn)一步堿提得到的PCP3和PCP5的異頭碳構(gòu)型為α型，PCP3含有四種糖殘基，PCP5含有兩種糖殘基。

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