牛大力多糖對(duì)小鼠抗疲勞作用的研究

羅 軒，林翠梧，陳潔晶，溫艷蓉，朱藝萍，莫 靜，李典鵬

1廣西植物研究所廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林541006;2廣西大學(xué)化學(xué)

化工學(xué)院，南寧530004;3廣西代謝性疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)人民解放軍第181醫(yī)院)，桂林541002

牛大力為豆科(Leguminosae)崖豆藤屬(Millettia)植物美麗崖豆藤(Millettia speciosa Champ．)的根，民間還稱其為豬腳笠、山蓮藕、金鐘根、倒吊金鐘、大力薯，分布福建、臺(tái)灣、廣西、廣東、湖北、貴州、江西等地，具有舒筋活絡(luò)、潤(rùn)肺滋腎、清熱止咳等功效［1］。自上世紀(jì)70年代起，牛大力被制藥企業(yè)加工成眾多中成藥。在《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》［2］中有17種中成藥的處方中含有牛大力。而民間(特別在廣東、香港等地)則將其作為滋補(bǔ)養(yǎng)身的燉湯原料，用于四肢乏力，產(chǎn)后虛弱，大病初愈。同時(shí)，在牛大力產(chǎn)地的一些中藥企業(yè)，正在對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)品開發(fā)，包括將牛大力(或其提取物)與其它食材制作成湯料包，提高其保健作用與產(chǎn)品附加值。

目前，從牛大力分離鑒定出了31個(gè)化學(xué)成分，包括:八個(gè)酚甙、13個(gè)黃酮類化合物、四個(gè)紫檀烷類化合物以及圓齒火棘酸、(–)-丁香脂素、dihydrodehydrodiconiferyl alcohol、5-羥甲基糠醛、α-甲氧基-2，5-呋喃二甲醇和 2，5-二羥基苯甲酸［3-7］。同時(shí)，暨南大學(xué)的鄭元升［8］對(duì)牛大力多糖的組成的活性進(jìn)行了初步研究，表明組成多糖的單糖成分主要為鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖。與此同時(shí)，對(duì)牛大力提取物活性研究表明，其水提物具有祛痰、鎮(zhèn)咳、平喘、抗炎、增強(qiáng)免疫力和保肝的作用［9-13］;其多糖具有較好的抗炎和抗腫瘤作用［8］;有進(jìn)一步深入開發(fā)利用的前景。特別是近幾年，不少研究人員選擇食品和中藥(尤其是藥食同源的中藥)作為研究對(duì)象，且研究結(jié)果表明這些食品和中藥的多糖都具有比較好的抗疲勞作用。因此，本研究將在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討牛大力多糖的抗疲勞作用，為綜合開發(fā)牛大力提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料、試劑與儀器

昆明種小鼠，SPF級(jí)(合格證號(hào):SCXK桂2009-0002)，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

牛大力粗多糖(NDL，含量為62．3%，多糖中單糖組成主要為鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和果糖［8］)，由本實(shí)驗(yàn)室提供;陽性藥人參蜂王漿，北京市東風(fēng)保健營(yíng)養(yǎng)品有限責(zé)任公司產(chǎn)品;乳酸(LD)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;尿素氮(BUN)測(cè)試盒、乳酸脫氫酶(LDH-L)測(cè)試盒，均為長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

爬桿架;游泳桶(大小約40 cm ×60 cm)，自制;JMA20002電子天平(余姚紀(jì)銘穩(wěn)重校驗(yàn)設(shè)備有限公司);722型可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);LG16-W型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。

1．2 方法

1．2．1 動(dòng)物分組與給藥

昆明種小鼠50只(18～22 g)，雌雄各半，隨機(jī)分成空白對(duì)照組(NC)，陽性藥人參蜂王漿(7 mL/kg)組(PC)，牛大力提取物高、中、低劑量組(NDLH、NDL-M、NDL-L)，每組 10 只。NDL-H、NDL-M、NDL-L 組按850、425、212．5 mg/(kg·d)進(jìn)行給藥。除NC組每天灌胃給予等體積的蒸餾水外，其余各組按照20 mL/kg體重灌胃相應(yīng)藥液，1次/d，連續(xù)14 d，灌喂期間自由攝食飲水。

1．2．2 小鼠一般情況與體重記錄

每天觀察小鼠的飲食、精神、毛發(fā)、大小便等情況。3 d稱重1次，共5次，記錄體重變化情況。

1．2．3 小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)［14，15］

各組小鼠連續(xù)給藥14 d，在第13 d給藥后30 min，將小鼠進(jìn)行爬桿訓(xùn)練，將不會(huì)爬桿的小鼠淘汰。在第14 d給藥后30 min，將小鼠置于長(zhǎng)48 cm、直徑1．0 cm的玻璃棒上，記錄小鼠自置于桿上至肌肉疲勞無力從桿上滑落下來所用的時(shí)間作為小鼠爬桿時(shí)間。

1．2．4 小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)［14，15］

各組小鼠連續(xù)給藥14 d，末次給藥后30 min，給小鼠尾負(fù)重5%體重的鉛絲，放入水溫28±1°C，水深不小于50 cm的游泳桶中游泳，用秒表記錄自游泳開始至頭部沉入水中8 s不能浮出水面的時(shí)間為力竭游泳時(shí)間。小鼠力竭游泳后，從小鼠眼眶靜脈叢取血約1 mL，待血液凝固后，3000 rpm離心10 min分離血清，取上清液，待用。

1．2．5 運(yùn)動(dòng)后小鼠血清乳酸、乳酸脫氫酶和尿素氮含量測(cè)定

取血清上清液20μL(尿素氮含量測(cè)定取10 μL)，參照試劑盒說明書方法進(jìn)行相關(guān)含量測(cè)定和計(jì)算。血清乳酸含量按公式(1)計(jì)算，乳酸脫氫酶和尿素氮含量按公式(2)計(jì)算。

式中:C樣為樣品管濃度;A樣為樣品管吸光度值;A標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值;C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)液濃度。

1．3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2．1 牛大力多糖對(duì)小鼠體重的影響

實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)小鼠體重進(jìn)行稱量和比較發(fā)現(xiàn)，在飼料量不加控制而自由攝食的情況下，各劑量NDL對(duì)雌、雄小鼠體重增長(zhǎng)均有不同程度影響，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 NDL對(duì)小鼠體重的影響(n=5，x±s)Table 1 Effect of NDLs on mice’s body weight(n=5±s)

表1 NDL對(duì)小鼠體重的影響(n=5，x±s)Table 1 Effect of NDLs on mice’s body weight(n=5±s)

組別Group初體重Initial body weight(g)最終體重The final body weight(g)體重增量Weight increment(g)體重增加率The increasing rate ofweight(%)22．0 ±1．0 27．4 ±1．3 5．4 ±1．4 24．5陽性對(duì)照組 PC 21．8 ±1．0 25．9 ±0．8 4．1 ±0．8 18．8牛大力多糖低劑量組 NDL －L 22．6 ±1．6 27．8 ±2．5 5．2 ±1．2 23．0牛大力多糖中劑量組 NDL －M 23．0 ±1．6 28．5 ±1．9 5．5 ±0．7 23．9牛大力多糖高劑量組 NDL －H 23．9 ±1．2 29．1 ±1．0 5．2 ±1．0 21．7空白對(duì)照組NC 雄性組 24．1± 1．6 34．6±2．2 10．6±0．8 44．0陽性對(duì)照組 PC 23．0 ±1．5 32．8 ±1．0 9．8 ±1．8 42．6牛大力多糖低劑量組 NDL －L 23．6 ±0．4 33．5 ±1．8 9．9 ±1．6 41．9牛大力多糖中劑量組 NDL －M 22．5 ±0．9 31．5 ±1．3 8．9 ±1．8 39．6牛大力多糖高劑量組空白對(duì)照組NC 雌性組NDL － H 23．8 ±1．8 32．0 ±1．8 7．7 ±1．1 32．3

從表1可知，雌性的NDL-L、NDL-M和NDL-H組小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)┚嘏c初始均重相比較分別增加了23．0%、23．9% 和 21．7%，都低于雌性 NC 組的24.5%。雄性的NDL-L、NDL-M和NDL-H組小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)┚嘏c初始均重相比較分別增加了41．9%、39．6%和32．3%，也都低于雄性NC組的44．0%。

2．2 牛大力多糖對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)耐力的影響

從表2數(shù)據(jù)說明，小鼠喂服牛大力多糖后，NDL-L組的數(shù)據(jù)與NC組對(duì)比，無顯著性差異。而NDL-M和NDL-H組小鼠在爬桿和游泳時(shí)間與NC組對(duì)比具有極顯著性差異(P ＜0．01)，且接近或好于PC組數(shù)據(jù)，說明牛大力多糖能夠提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，具有延長(zhǎng)小鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間的功能，且最低起效濃度在212．5mg/kg，當(dāng)濃度達(dá)到425mg/kg時(shí)，與7 mL/kg人參蜂王漿的功效基本相當(dāng)。

表2 NDL對(duì)小鼠爬桿時(shí)間及其游泳時(shí)間的影響(n=10，x±s)Table 2 Effect of NDLs on the pole-climbing and loaded swimming time ofmice(n=10±s)

表2 NDL對(duì)小鼠爬桿時(shí)間及其游泳時(shí)間的影響(n=10，x±s)Table 2 Effect of NDLs on the pole-climbing and loaded swimming time ofmice(n=10±s)

注:a．NDL-L組在游泳實(shí)驗(yàn)中有一只小鼠負(fù)重脫落，因此n=9。與空白對(duì)照組比較，*P ＜0．05;＊＊P ＜0．01。Note:a．In NDL-L group，n=9，because the load on themouse tail dropped．Compare with control，*P ＜ 0．05;＊＊P ＜ 0．01．

游泳實(shí)驗(yàn)組別Group爬桿實(shí)驗(yàn)The pole-climbing assay The loaded swimming assay時(shí)間Time(min)延長(zhǎng)率The rate of change(%)時(shí)間Time(min)延長(zhǎng)率The rate of change(%)空白對(duì)照組72．9 NC 0．91 ±0．55 7．70 ±3．97陽性對(duì)照組 PC 2．45 ±0．92＊＊ 169．9 12．90 ±6．27* 67．6牛大力多糖低劑量組 NDL-L 1．35 ±0．99 49．5 5．08 ±3．75a -34．0牛大力多糖中劑量組 NDL-M 2．45 ±0．85＊＊ 169．2 12．67 ±5．38* 64．6牛大力多糖高劑量組 NDL-H 2．78 ±1．87＊＊ 206．4 13．60 ±5．67*

2．3 牛大力多糖對(duì)小鼠血乳酸含量的影響

表3數(shù)據(jù)說明，各受試組小鼠在連續(xù)喂服牛大力多糖14 d并負(fù)重游泳后，血乳酸含量與NC組對(duì)比有明顯下降(P ＜0．05)。與爬桿和游泳時(shí)間得出的規(guī)律類似，NDL-M組的血乳酸含量降低率與PC組基本一致，而當(dāng)喂服牛大力多糖濃度提高一倍后，對(duì)運(yùn)動(dòng)后血乳酸含量降低的影響非常有限，因此425 mg/kg的牛大力多糖可能是喂服小鼠的極限值。超過該值后，對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)后血乳酸含量的降低沒有明顯影響。

表3 NDL對(duì)小鼠血乳酸含量的影響(n=10±s)Table 3 Effect of NDLs on blood lactic acid ofmice(n=10±s)

表3 NDL對(duì)小鼠血乳酸含量的影響(n=10±s)Table 3 Effect of NDLs on blood lactic acid ofmice(n=10±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P ＜0．05。Note:Comparewith control，*P ＜ 0．05．

)

2．4 牛大力多糖對(duì)小鼠血乳酸脫氫酶含量的影響

表4數(shù)據(jù)表明，連續(xù)喂服牛大力多糖14 d，且進(jìn)行負(fù)重游泳后，各受試組小鼠的血乳酸含量與NC組對(duì)比，均有明顯下降(P ＜0．05)，說明牛大力多糖可以通過乳酸脫氫酶加速分解乳酸以及減少運(yùn)動(dòng)中乳酸的生成，達(dá)到延緩疲勞產(chǎn)生的效果。

表4 NDL對(duì)小鼠血乳酸脫氫酶含量的影響(n=8±s)Table 4 Effect of NDLs on blood lactate dehydrogenase-L ofmice(n=8±s)

表4 NDL對(duì)小鼠血乳酸脫氫酶含量的影響(n=8±s)Table 4 Effect of NDLs on blood lactate dehydrogenase-L ofmice(n=8±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P ＜ 0．05;＊＊P ＜ 0．01。Note:Comparewith control，*P ＜ 0．05;＊＊P ＜ 0．01．

組別Group泳后乳酸脫氫酶含量The content of blood lactate dehydrogenase-L after swimming(mmol/L)增加率The rate of change(%)NC 985．6 ±398．0陽性對(duì)照組 PC 1926．5 ±758．0＊＊ 95．5牛大力多糖低劑量組 NDL-L 1742．4 ±707．4＊＊ 76．8牛大力多糖中劑量組 NDL-M 2009．9 ±828．9＊＊ 103．9牛大力多糖高劑量組NDL-H 1710．8±610．2*空白對(duì)照組73．6

2．5 牛大力多糖對(duì)小鼠血清尿素氮含量的影響

表5數(shù)據(jù)反映了在負(fù)重游泳后，各受試組小鼠尿素氮含量的變化趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，牛大力多糖能明顯減少運(yùn)動(dòng)后小鼠血清尿素氮的產(chǎn)生，使小鼠更能適應(yīng)大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)。該組數(shù)據(jù)的變化規(guī)律與前三個(gè)數(shù)據(jù)的變化規(guī)律略有不同。當(dāng)牛大力多糖喂服量達(dá)最高值時(shí)，其對(duì)小鼠血清尿素氮含量的影響與PC組基本相當(dāng)。

3 結(jié)論

疲勞的評(píng)價(jià)方法主要有運(yùn)動(dòng)耐力試驗(yàn)和生化改變的檢測(cè)。運(yùn)動(dòng)耐力的提高是抗疲勞能力加強(qiáng)最直接的表現(xiàn)。游泳和爬桿時(shí)間的長(zhǎng)短可以反映動(dòng)物運(yùn)動(dòng)疲勞(動(dòng)態(tài)和靜態(tài))的程度，因此一直以來被作為反映運(yùn)動(dòng)耐力的重要指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，比NC組小鼠的力竭游泳和爬桿時(shí)間對(duì)比，牛大力多糖可明顯延長(zhǎng)小鼠力竭游泳和爬桿時(shí)間，降低運(yùn)動(dòng)后小鼠血乳酸和尿素氮水平，提高乳酸脫氫酶水平，說明牛大力多糖在提高機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)能力，提高運(yùn)動(dòng)耐力和快速消除代謝廢物方面有很明顯的作用。根據(jù)抗疲勞保健食品的評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法，若一項(xiàng)以上(含一項(xiàng))運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)和兩項(xiàng)以上(含兩項(xiàng))生化指標(biāo)為陽性，即可判斷該受試物具有抗疲勞作用［16］。

表5 NDL對(duì)小鼠血清尿素氮含量的影響(n=5±s)Table 5 Effect of NDLs on serum urea nitrogen ofmice(n=5±s)

表5 NDL對(duì)小鼠血清尿素氮含量的影響(n=5±s)Table 5 Effect of NDLs on serum urea nitrogen ofmice(n=5±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P ＜0．05。Note:Comparewith control，*P ＜ 0．05．

組別Group泳后血清尿素氮含量The content of serum urea nitrogen after swimming(mmol/L)降低率The rate of change(%)NC 14．7 ±4．7陽性對(duì)照組 PC 8．5 ±4．1* 42．3牛大力多糖低劑量組 NDL-L 11．0 ±0．9* 25．3牛大力多糖中劑量組 NDL-M 9．5 ±0．9* 34．9牛大力多糖高劑量組NDL-H 8．8±3．7*空白對(duì)照組39．8

根據(jù)表1小鼠體重的變化，以及實(shí)驗(yàn)中對(duì)小鼠體型的觀察(高劑量組小鼠都明顯較NC組瘦長(zhǎng))，NDL可能具有一定毒性，對(duì)小鼠體重的增長(zhǎng)具有一定的抑制作用，且抑制作用在雄性中更為明顯。而表2至表5的結(jié)果表明，NDL-M組小鼠的各項(xiàng)數(shù)據(jù)與PC組的數(shù)據(jù)非常相近，說明該劑量的牛大力多糖與7 mL/kg人參蜂王漿的功效基本相當(dāng)。當(dāng)牛大力多糖喂服含量提高一倍后，小鼠的爬桿和游泳時(shí)間并沒有大幅度提高，且乳酸脫氫酶的影響出現(xiàn)下降，這可能是由于“超量抑制效應(yīng)”造成的［17］。有關(guān)牛大力多糖發(fā)揮抗疲勞作用的具體機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究探討，以擴(kuò)展牛大力資源在醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域的應(yīng)用。

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