響應面分析法優化枸杞多糖的提取工藝

李丹丹 吳茂玉 宋 燁 朱風濤 馬曉燕

（1.齊魯工業大學食品與生物工程學院，山東濟南250353；

2.中華全國供銷合作總社濟南果品研究院，山東濟南250014）

枸杞（Lycium barbarumL.）是茄科枸杞屬的多分枝灌木植物，主要產于我國新疆、青海、寧夏等地，國外主要分布在日本、朝鮮、歐洲及北美等地。枸杞含有豐富的多糖、脂肪、蛋白質、游離氨基酸及維生素等，特別是類胡蘿卜素含量很高[1]。研究表明，枸杞具有滋肝養腎、明目的功效[2]。在枸杞眾多功效成分中，對枸杞多糖（Lycium Barbarum Polysaccharides,LBP）的研究最為熱門，近代研究發現，枸杞多糖具有增強機體免疫力、抗腫瘤、防衰老、增加造血功能等活性功能[3]。因此提取枸杞多糖對開發和利用枸杞資源有重要的意義。

本文就提取中影響枸杞多糖得率的幾個重要因素做了系統研究，并運用響應面分析（Response Surfaceanalysis,RSA）法[4]對枸杞多糖的提取條件進行了優化。用Box-Behnken的中心組合實驗設計，對實驗數據進行分析，對擬合數學模型進行了較為詳細的描述，得到了枸杞多糖提取的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

干制枸杞，購買于新疆中寧縣。

1.1.2 實驗試劑

葡萄糖，硫酸，苯酚，酒石酸鉀鈉，無水亞硫酸鈉，氫氧化鈉，3,5-二硝基水楊酸等，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器和設備

數顯式電熱恒溫水浴鍋，購于上海博迅實業有限公司醫療設備廠；萬能粉碎機，購于天津市泰斯特儀器有限公司；TU180紫外可見分光光度計，購于北京普析通用儀器有限公司；

SHB-Ⅲ循環水式真空泵，購于鄭州長城科工貿有限公司；

R-3旋轉蒸發儀，購于瑞士。

1.3 實驗方法

1.3.1 熱水浸提枸杞多糖的工藝流程

圖1 熱水浸提LBP的工藝流程Fig.1 The process of hotwater extract LBP

1.3.2 標準曲線的繪制

總糖標準曲線的繪制：采用苯酚硫酸法[5]。用分析天平精確稱取10mg干燥恒重的無水葡萄糖，溶解定容100mL配制成濃度為100μg/mL的葡萄糖標準液備用。分別移取 0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL葡萄糖標準溶液置于編號為 0、1、2、3、4、5、6的試管中，其中0號管為空白對照。向各試管加入蒸餾水達到液體總量為2.0mL，分別加入1.0mL 6%苯酚，搖勻后立即加入5.0mL濃硫酸，室溫放置15min后沸水浴30min，冷卻后在490nm波長處測定吸光值，制作標準曲線。

還原糖標準曲線的繪制：采用3,5-二硝基水楊酸法（DNS法）[6]。

DNS溶液的配制：稱取酒石酸鉀鈉182g，用500mL蒸餾水溶解，水浴加熱（不超過50℃），在熱溶液的環境下加入6.3g 3,5-二硝基水楊酸、2.1g NaOH、5.0g重結晶酚、5.0g無水Na2SO3，不停地攪拌至充分溶解，冷卻后用蒸餾水定容于1L容量瓶中，備用。

還原糖標準曲線的繪制：用分析天平精確稱取100mg干燥且恒重的無水萄糖，蒸餾水定容于100mL容量瓶中，配成濃度為1mg/mL的標準液。精密移取 0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL標準液分別置于編號為 0、1、2、3、4、5、6的25mL容量瓶中，其中0號為空白對照，用蒸餾水補至2.0mL。然后分別加入DNS試劑1.5mL，搖勻，放入沸水浴中加熱5min，立刻用流水冷卻，定容，搖勻，2min后于540nm波長處測定吸光值，繪制出標準曲線。

1.3.3 枸杞多糖得率的計算

取一定體積的多糖浸提液并用蒸餾水稀釋到標準曲線的濃度范圍內，按照1.3.2的方法進行顯色，根據標準曲線分別計算總糖、還原糖的量和多糖含量。

式中：枸杞干粉的質量，g。

1.3.4 枸杞多糖最佳提取工藝條件的確定

通過單因素試驗結果分析，選擇料液比、浸提溫度、浸提時間為試驗因素，以多糖得率為衡量指標，對影響多糖得率的因素進行了Box-Behnken試驗，運用Design Expert6.0軟件進行響應面分析，優化得到最佳提取工藝條件。

2 結果與分析

2.1 提取枸杞多糖的單因素試驗

2.1.1 料液比對枸杞多糖得率的影響

圖2 料液比對枸杞多糖得率的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on the yield of LBP

稱取一定質量的枸杞粉，分別設計料液比為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30，單位為 g/mL，在某個溫度下提取一定的時間，不同料液比下的枸杞多糖得率如圖2所示。

由圖2可以看出，在其他條件一定的情況下，隨著料液比的減小，枸杞多糖的得率逐漸增大并且呈明顯的上升趨勢。當料液比增加到1:30時，枸杞多糖的得率達到最大值，但此時的得率與1:25條件下的得率相差很小，基本上呈持平狀態，可知，當料液比超過1:25時，料液比的減小對枸杞多糖得率的影響不明顯，因此從經濟的角度考慮，料液比選擇1:25較為適宜。

2.1.2 浸提溫度對枸杞多糖得率的影響

稱取一定質量的枸杞粉末，按料液比為1:25添加蒸餾水，分別于 50、60、70、80、90、100℃下浸提一定的時間，不同反應溫度下的枸杞多糖的得率如圖3所示。

圖3 浸提溫度對枸杞多糖得率的影響Fig.3 Effects of extraction tem perature on the yield of LBP

由圖3可知，溫度對枸杞多糖的得率影響較大，隨著溫度的不斷上升，枸杞多糖的得率也在不斷增加。反應溫度為100℃時多糖得率達到實驗最大值，但相比于90℃時的得率而言增長空間較小，這可能是高溫導致了多糖的降解，從而降低了多糖的浸出率[7]。因此，多糖浸出的適宜溫度為90℃。

2.1.3 浸提時間對枸杞多糖得率的影響

稱取一定質量的枸杞粉末，按料液比為1:25添加蒸餾水，分別于90℃下水浴加熱浸提0.5、1、1.5、2、2.5、3h，多糖得率隨著反應時間的變化曲線如圖4所示。由圖可知，隨著反應時間的延長，多糖的得率呈現急劇增加的趨勢，當時間達到2.5h時曲線逐漸趨于平衡。可見加熱浸提2.5h以后，多糖的得率變化不明顯，這可能是由于長時間的加熱引起了多糖的降解，從而使得多糖得率下降[8]。所以綜合考慮，選擇熱水浸提時間為2.5h。

圖4 浸提時間對枸杞多糖得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on the yield of LBP

2.2 采用響應面分析法對枸杞多糖提取工藝的優化

2.2.1 響應面分析因素水平的選取

表1 試驗設計因素與水平取值Tab.1 Code and level of variables chosen for the trials

表2 Box-Behnken實驗設計及響應值Tab.2 Box-Behnken experimental design arrangement and responses

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Analysis of variance(ANOVA)for regression equation for liquefaction process

根據的Box-Behnken試驗設計原理，結合單因素試驗的結果，選取料液比（X1）、浸提溫度（X2）、浸提時間（X3）為考察因素，用 -1、0、1來表示低、中、高三水平，進行三因素三水平響應面優化試驗，響應面試驗設計因素與水平取值見表1。

2.2.2 響應面分析實驗設計方案及結果

以上述因素為自變量，以多糖得率（Y）為響應值，進行響應面分析試驗，試驗設計及試驗結果見表2。

利用Design Expert6.0軟件對表2中的結果進行回歸分析，對各因素回歸擬合后，得到多糖得率對料液比（X1）、浸提溫度（X2）、浸提時間（X3）的 3元 2次回歸方程為：

對回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗結果如表3所示。從表3可知，回歸項F值=97.21，P＜0.0001，說明所選擇模型極顯著。表中的X1、X2、X3、X12、X22、X32、X1X3的 Pr＞F值均小于 0.0001，說明這些均是極顯著的模型項。失擬項F值為1.93，說明失擬項和純誤差的差異不顯著，表明該二次回歸模型能夠較顯著擬合料液比、浸提溫度、浸提時間對枸杞多糖得率的影響。回歸模型的決定系數R2=0.9921，說明響應值的變化有99.21%來自于所選變量，因此回歸方程可以很好地描述各因素與響應值之間的關真實關系，可以利用該回歸方程確定最佳提取條件。

2.2.3 各因素間的交互作用

根據以上回歸方程，利用Design Expert6.0軟件做不同因素間的響應面分析圖和等高線圖，如圖5、圖6、圖7所示。該圖組可直觀地反映各因素及其交互作用對多糖得率的影響結果。其中等高線的形狀可以反映兩因素間交互作用的強弱，橢圓形表示兩因素間交互作用較強，圓形則相反[9,10]。

圖5 料液比與浸提溫度對枸杞多糖得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot of the effects of solid-liquid ratio and extracting tem perature on the yield of LBP

從圖5～7可以直觀地看出各因素的交互作用對響應值的影響，確定最佳因素水平范圍。根據Box-Behnken的中心組合試驗，對回歸方程求一階偏導方程等于零[11]，整理得響應值最大時，X1=0.372，X2=0.12，X3=-0.02，對三種影響因素分別作如下變換：X1=(z-25)/5、X2=(T-80)/10、X3=(t-2.5)/0.5，所以對應的提取枸杞多糖的工藝條件為：料液比1:26.86，浸提溫度81.2℃，浸提時間為2.51h。但考慮到實際操作的便利性，將提取枸杞多糖的最佳工藝條件修正為料液比1:27，浸提溫度81℃，浸提時間為2.5h。并驗證此條件下的枸杞多糖得率為5.03%，與模型預測值比較接近，說明用響應面法優化提取枸杞多糖的工藝參數可靠。

圖6 料液比與浸提時間對枸杞多糖得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot of the effects of solid-liquid ratio and extracting time on the yield of LBP

圖7 浸提溫度與浸提時間對枸杞多糖得率影響的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot of the effects of the extracting tem perature and time on the yield of LBP

3 結論

通過單因素實驗設計，以及在此基礎上通過設計3因素3水平響應面分析法實驗，最終確定出枸杞多糖的提取最佳工藝參數：料液比1:27g/mL、浸提溫度81℃、提取時間2.5h。在此工藝條件下提取的枸杞得率較高，實際得率可達5.03%。

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