響應面分析法優化超聲提取黑豆皮色素的工藝研究

王玲麗，郭艷茹

(運城學院 生命科學系，山西運城044000)

黑豆又稱黑大豆，為豆科植物大豆(Glycine max)的黑色種子，有祛風除熱、保腎健脾、活血、利尿、解毒、明目之功效，其藥食俱佳，既可以作為食品又可以作為藥材［1］。黑豆皮，中藥稱“料豆衣”，有解毒利尿的功效，含有大量紅色素，飛燕草素－3－葡萄糖苷和矢車菊素－3－葡萄糖苷為其主要成份［2］。從黑豆種皮中提取的黑豆皮色素屬花色苷類化合物，其色彩鮮明，有良好的染色作用，是一種理想的天然色素和重要的食品添加劑［3］。另外黑豆的色素和多糖有很強的抗氧化功能，其清除自由基能力甚至高于黑米［4］，其清除能力是維生素C的116倍［5］。張瑞芬等研究了黑豆種皮提取物對老齡小鼠具有延緩衰老作用［6］。黑豆花青素有調節毛細血管的滲透作用，可以改善微循環，還會影響免疫功能［7］。一些化學合成色素有慢性毒性，甚至一些還有致癌性，潛在的危害促使人們尋找新的、安全的可食用色素［8］。黑豆皮紅色素作為食品添加劑，綠色、健康，相比于合成色素，安全性更高，具有一定的營養價值和醫療作用，并且由于易得的原料，生產技術簡單，因此受到越來越多的消費者的青睞［9］。本實驗優化了超聲提取黑豆皮色素的工藝條件，為黑豆皮色素的綜合開發和利用提供理論依據。

1.材料與試劑

黑豆，購于山西省金鼎種業公司。將黑豆浸泡于水中12小時，手工剝皮，陰干后放置60℃電熱鼓風干燥箱內進行干燥，研磨成粉末，60目過篩后備用。

乙醇、鹽酸、氫氧化鈉等化學試劑均為分析純。

KQ—500DE型數控超聲波清洗器;UV759CRT紫外可見分光光度計;HHS型恒溫水浴鍋;E438酸度計。

2.方法與結果

2.1 黑豆皮色素最大吸收波長的確定

由于天然色素提取物中存在大量非色素成分，因此，黑豆皮紅色素測定中，其含量無法直接表示，故本文用吸光值來表示［10］。

精確稱取干燥的黑豆皮0.5g，放置于錐形瓶中，按固液比1∶30，加入60%的乙醇15 mL，調pH至1.5，在60℃、400 W下超聲提取50 min，抽濾或離心得到濾液。取1mL提取液，用蒸餾水稀釋至10 mL，分別在 472 nm、482 nm、492 nm、502 nm、512 nm、522 nm、532 nm、542 nm、552 nm 下測其吸光值。不同波長下的吸光值如圖1。由圖可知，黑豆皮色素的吸收峰在波長為512 nm處。

2.2 單因素試驗

圖1 黑豆皮色素最大吸收波長

2.2.1 乙醇濃度對黑豆皮色素的影響

精確稱取干燥的黑豆皮5份，每份0.5 g，按固液比1∶30，分別加入40%、50%、60%、70%、80%乙醇各15 mL，調pH至1.5，在60℃、400 W下超聲提取50 min，離心得到濾液。于512 nm下測定其吸光度考察乙醇濃度對黑豆皮色素的影響，結果如圖2:

圖2 乙醇濃度對黑豆皮色素的影響

由圖2可知，隨著乙醇濃度的增加，黑豆皮色素吸光值逐漸增大，當乙醇濃度增至60%時，其吸光值最大，隨后隨乙醇濃度增加，吸光值呈下降趨勢。因為黑豆皮色素中花色苷為主要成分，所以黑豆皮色素呈中等極性。根據“相似相溶”原理，黑豆皮色素易溶于中等或中等偏上極性的溶劑中。在乙醇溶液中，由于羥基的引入，彼此以氫鍵相連的乙醇分子之間，和水分子也形成氫鍵，降低了水的極性［11］。所以提取劑濃度選為體積分數60%。

2.2.2 固液比對黑豆皮色素的影響

精確稱取干燥的黑豆皮5份，每份0.5 g，分別按固液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 加入60%的乙醇，調pH至1.5，在60℃、400 W下超聲提取50 min，離心得到濾液。于512 nm下測定其吸光度考察固液比對提取黑豆皮色素的影響，結果如圖3:

圖3 固液比對黑豆皮色素的影響

由圖3可知，固液比小于1∶40時，黑豆皮色素不能被完全提取出來，隨著固液比進一步增加至1∶40時，吸光值達到最大，因此，最佳固液比為1∶40。

2.2.3 pH值對黑豆皮色素的影響

精確稱取干燥的黑豆皮4份，每份0.5 g，按固液比1∶30，加入60%的乙醇15 mL，分別調pH至0.5、1、1.5、2 四個梯度，在 60 ℃、400 W 下超聲提取50 min，離心得到濾液。于512 nm下測定其吸光度考察pH值對黑豆皮色素的影響，結果如圖4:

圖4 pH值對黑豆皮色素的影響

由圖4可知，pH值小于1.5時，黑豆皮色素吸光值隨著pH值的增加而增大，當溶液pH值大于1.5時，吸光值急劇下降，這是由于pH值的變化改變了色素的結構，因此選溶液pH為1.5為宜。

2.2.4 超聲時間對黑豆皮色素的影響

精確稱取干燥的黑豆皮5份，每份0.5 g，按固液比1∶30，加入60%的乙醇15mL，調 pH 至1.5，在60℃、400 W下分別超聲提取40 min、50 min、60 min、70 min、80 min，離心得到濾液。于512 nm 下測定其吸光度考察超聲時間對黑豆皮色素的影響。結果圖5:

圖5 超聲時間對提取黑豆皮色素的影響

由圖可知，超聲時間小于60 min時，黑豆皮色素提取不完全。當超聲時間大于60 min時，由于黑豆皮色素會因時間的延長，而逐漸氧化分解，吸光值開始下降。因此以60 min為超聲提取時間。

2.3 優化實驗

2.3.1 響應面分析因素水平的選取及實驗設計

綜合考慮單因子實驗結果，根據 Box－Behnken的中心組合設計原理，采用響應面法在四因子三水平上對超聲提取黑豆皮色素的工藝條件進行了優化，因子和水平見表1:

表1 響應面分析因子和水平

數據處理采用 Design expert 8.0.4軟件，中心組合實驗設計方案及色素吸光值的響應值見表2。其中29個試驗點分為析因點和0點，其中析因點為自變量，取值在由－1，0，1構成的三維頂點，0點為區域的中心點，重復試驗5次，用來估計試驗誤差。

表2 響應面分析實驗結果

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2.3.2 回歸模型的建立及其分析

利用Design Expert 8.0.4軟件，通過響應面回歸方程分析數據(分析結果見表3)，建立吸光度的回歸模型，尋找其最優的反應條件。根據參數分析對實驗數據進行多項式擬合回歸，得到實驗實際的回歸方程如下:

表3 模型回歸系數顯著性檢驗和結果檢驗

從表3模型系數顯著性檢驗可知:實驗模型對實驗擬合良好，模型的P＜0.0001，表明該實驗模型顯著。另外，A、B、D、A2、B2、C2、D2影響顯著，交互項均不顯著。失擬項的F值是2.17，其P＞0.05，表明失擬項相對于純誤差是不顯著的。各交互因素響應曲面圖見圖6。

圖6 各因素交互作用的等高線和響應面圖

2.3.3 優化條件的模型驗證

利用Design－Expert8.0.4統計軟件求解回歸方程得到黑豆皮色素的最佳提取工藝條件為:固液比1∶36.23，乙醇濃度是 55.25%，超聲時間 62.73 min，pH值為1.41。此時黑豆皮色素吸光值為0.707。為了驗證響應面法的可靠性，同時考慮到實際生產操作的便利性，對得到的最佳提取工藝條件進行驗證實驗，以固液比1∶36，乙醇濃度是55%，超聲時間63min，pH值1.4，此時黑豆皮平均色素吸光值為0.692，與理論值相差較小，因此通過響應面法優化得到的黑豆皮色素的超聲提取工藝條件是可行的，具有實際生產價值。

3.結論

黑豆是一種傳統的黑色食品。黑豆有清除自由基、抗衰老、增強免疫力、改善睡眠等保健功能。黑豆皮色素作為黑豆中的有效成分是一種理想的天然食用色素［12］。目前有關黑豆種皮紅色素提取方法主要有鹽酸－乙醇提取法、微波輔助提取法和超聲波輔助提取法［13］。其中超聲技術提取天然有效成分具有明顯的優勢，利用超聲波產生的強大的振動、空化效應、攪拌作用，可以使活性成分快速溶入溶劑，有效提高萃取率，縮短提取時間。將黑豆皮色素用超聲波提取法直接從天然植物黑豆皮中浸提，生產工藝簡單合理，提取過程不使用任何手段或藥劑導致色素產生有害變化。因此，可廣泛用于藥品、化妝品、食品的著色和配料，是一種具有廣闊前景及應用價值的天然色素［14］。

響應面分析是一種最優化方法，它是將體系的響應作為一個或多個因素的函數，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，運用圖形技術將這種函數關系顯示出來，使人們可以憑直接的觀察來從實驗設計中選擇最優化的條件，通過對回歸方程的分析尋找最優的工藝參數［15］。黑豆皮色素提取的最佳工藝條件為:固液比1∶36.23，乙醇濃度是 55.25%，超聲時間 62.73 min，pH值為1.41。

實驗過程中有些黑豆皮粉末會沉積在錐型瓶底部，采用磁力攪拌有望提高黑豆皮紅色素的提取效果。

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