蛋白酶激活受體-2激動藥對重癥急性胰腺炎大鼠腸道SIgA的影響*

夏亮,曾振國,劉丕,曾皓,朱勇,呂農華

(南昌大學第一附屬醫院1.重癥醫學科;2.消化內科,南昌 330006)

蛋白酶激活受體-2激動藥對重癥急性胰腺炎大鼠腸道SIgA的影響*

夏亮1,曾振國1,劉丕2,曾皓2,朱勇2,呂農華2

(南昌大學第一附屬醫院1.重癥醫學科;2.消化內科,南昌 330006)

目的 研究重癥急性胰腺炎(SAP)大鼠腸黏膜免疫屏障的變化及蛋白酶激活受體(PAR)-2激動藥對其的影響。方法制備SAP大鼠模型,采用PAR-2激動藥進行預處理,檢測假手術組、模型組及預處理組造模后6,12,24 h大鼠小腸黏液分泌性免疫球蛋白A(SIgA),小腸組織病理學、小腸組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6。組間數據比較采用單因素方差分析,小腸組織TNF-α、IL-6與小腸黏液SIgA,小腸組織病理學評分之間的相關性采用線性相關分析。結果模型組與假手術組相比,隨造模時間的延長,小腸黏液SIgA濃度降低,小腸組織病理學評分及小腸組織TNF-α、IL-6水平升高(P＜0.05),預處理組與模型組相比,小腸黏液SIgA濃度升高,小腸組織病理學評分及小腸組織TNF-α、IL-6水平降低(P＜0.05),小腸組織TNF-α、IL-6水平與小腸組織病理學評分具有明顯的正相關(P＜0.01),與小腸黏液SIgA之間具有明顯的負相關(P＜0.01)。結論SAP大鼠早期即發生腸黏膜免疫功能下降,免疫屏障受損; SLIGKV-NH2預處理SAP大鼠后,能顯著降低小腸局部主要炎癥因子水平,改善腸黏膜免疫屏障損傷程度。

蛋白酶激活受體-2激動藥;胰腺炎,急性,重癥;腸黏膜屏障;分泌性免疫球蛋白A;腫瘤壞死因子-α;白細胞介素-6

胰腺繼發感染是重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)最嚴重的并發癥,研究表明SAP早期發生的腸黏膜屏障功能障礙是導致胰腺繼發感染的重要因素,其中免疫屏障受損是腸黏膜屏障功能障礙的重要組成部分[1],但其病理生理過程并不十分清楚。蛋白酶激活受體-2(protease-activated receptors 2,PAR-2)是一種細胞膜表面受體,廣泛分布于胃腸道,可被多種蛋白酶激活,產生多種生物學效應,本研究前期實驗表明PAR-2與SAP大鼠腸黏膜屏障關系密切,在病情進展過程中PAR-2基因和蛋白表達均明顯上調[2],因此,PAR-2作為腸黏膜的保護性受體之一,激活后很可能對SAP大鼠起到保護作用。筆者在本研究應用人工合成PAR-2的選擇性激動藥——SLIGKV-NH2對SAP大鼠進行預處理,通過觀察腸黏膜組織主要炎癥遞質水平的變化、腸黏膜免疫屏障相關指標改變,綜合評估SLIGKV對SAP 炎癥反應調節和腸黏膜屏障的生物學作用,初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康清潔級SD大鼠(合格證號: 0032135)108只,8～12周齡,體質量為200～250 g,雌雄不拘,由南昌大學實驗動物中心提供,許可證號: SYXK(贛)2010-0002,實驗過程中對動物的處理嚴格遵循《實驗動物管理條例》。

1.1.2 主要試劑 SLIGKV-NH2(批號:C0803070001,純度:98%)為西安聯美生物科技有限公司產品,牛磺膽酸鈉為美國Sigma公司產品,大鼠細胞因子試劑盒、SIgA試劑盒為美國R&D公司產品(批號分別為: 213547,217261,21471),水合氯醛為北京Solarbio公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 108只大鼠按拆信封法隨機分成假手術組、模型組與預處理組,各組再分別按6,12, 24 h三個時間點分成3小組,每組12只,實驗前各組大鼠均禁食12 h,自由飲水。

1.2.2 模型制備 ①模型組大鼠采用逆行胰膽管注射5%牛磺膽酸鈉溶液0.15 mL·(100 g)-1方法制備SAP模型[2]。術后于大鼠背部皮下注射無菌0.9%氯化鈉溶液2 mL·(100 g)-1,以補充失液,術后大鼠仍禁食,清醒后自由飲水。②假手術組開腹后僅翻動胰腺和十二指腸后關腹,術后處理同模型組。③預處理組造模前5 min腹腔注射10%SLIGKV-NH2(2 mg·kg-1),造模后1 h背部皮下注射相同劑量SLIGKV-NH2,余同模型組。

1.2.3 腸黏膜標本的采集和處理 實驗結束后,處死所有大鼠,開腹在距離回盲部近端約3 cm處剪取腸段約2 cm,固定于10%中性緩沖甲醛溶液中,用于蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色;在距離回盲部近端約9 cm處剪取腸段約2 cm,用于制備小腸組織勻漿。在距離回盲部近端約12 cm處剪取腸段約10 cm,用于檢測小腸黏液SIgA。①小腸組織勻漿制備:將剪取腸段放入冰0.9%氯化鈉溶液中洗凈,在4℃條件下,準確稱量小腸組織0.5 g,加預冷0.9%氯化鈉溶液5 mL制備勻漿,而后4℃離心,取上清液置-80℃冰箱凍存待檢。②小腸黏液制備:將剪取腸段縱行剖開,暴露黏膜面,輕輕刮除腸腔內成型大便,稱定質量,再用載玻片刮取腸黏液5次,收集于EP管中,加入0.01 mol·L-1磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)1 mL,充分溶解, 20 000 r·min-1離心10 min,取上清液,置-80℃冰箱凍存待檢。

1.2.4 檢測指標

1.2.4.1 腸黏膜組織腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-6,小腸黏液SIgA 前一晚將待測標本從-80℃冰箱中取出,放入-4℃冰箱,而后再放入4℃冰箱中復溫待檢;各試劑在使用前平衡至室溫,集中采用酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immuno-sorbent assay,ELISA)檢測小腸組織勻漿中TNF-α、IL-6,小腸黏液SIgA。

1.2.4.2 小腸組織學 常規制作石蠟切片,HE染色,光鏡下觀察小腸組織病理學改變,參照Chiu評分法對小腸病理損傷程度進行評分[3]。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0版統計學軟件進行統計分析。數據以均數±標準差(±s)表示,組間數據比較采用單因素方差分析,小腸組織勻漿TNF-α、IL-6與小腸黏液SIgA、小腸組織學評分之間的相關性采用線性相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小腸組織勻漿TNF-α的測定 模型組及預處理組造模后,6 h小腸組織勻漿TNF-α濃度升高,并持續升高至24 h,各時點與假手術組比較,均差異有統計學意義(F=992.23,P＜0.05);預處理組造模后各時間點小腸組織勻漿TNF-α濃度均低于同時間點模型組,差異有統計學意義(F=808.52,P＜0.05);假手術組關腹后,小腸組織勻漿TNF-α濃度無明顯變化,各時點相比均差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 小腸組織勻漿IL-6的改變 模型組及預處理組造模后,6 h小腸組織勻漿IL-6濃度升高,并持續升高至24 h,各時間點與假手術組比較,均差異有統計學意義(F=643.24,P＜0.01);預處理組造模后各時間點小腸組織勻漿IL-6濃度均低于同時間點模型組,均差異有統計學意義(F=261.55,P＜0.05);假手術組關腹后,小腸組織勻漿IL-6濃度無明顯變化,各時間點相比均差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.3 小腸黏液SIgA的改變 模型組及預處理組造模后,6 h小腸黏液SIgA濃度降低,并持續至24 h,各時間點與假手術組相比,均差異有統計學意義(F= 314.90,P＜0.01);預處理組造模后12及24 h小腸黏液SIgA濃度均高于同時間點模型組,差異有統計學意義(F=131.62,P＜0.01);假手術組關腹后,小腸黏液SIgA濃度無明顯變化,各時點相比均無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.4 小腸組織病理學的改變

2.4.1 小腸病理學改變 假手術組:各小組小腸組織結構完整,細胞形態正常,間質無明顯水腫。模型組:隨造模時間延長,逐漸出現小腸黏膜內絨毛頂端上皮下間隙增大,炎癥細胞浸潤,直至出現絨毛破損、脫落、壞死、彌漫性炎癥細胞浸潤。預處理組:各時間點仍可見絨毛頂端上皮下間隙增大,間質水腫,炎癥細胞浸潤,甚至可見少許絨毛破損、脫落,且隨模型時間延長而有不同程度加重,但與同時間點模型組比較,損傷程度有所減輕。見圖1。

2.4.2 小腸病理學評分改變 模型組及預處理組造模后,6 h小腸病理學評分升高,并持續至24 h,與同時間點假手術組比較,均差異有統計學意義(F= 1 831.62,P＜0.01);預處理組造模后12與24 h小腸病理學評分低于同時間點模型組,差異有統計學意義(F=1 347.62,P＜0.05);假手術組各時點小腸病理學評分相比,均差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

2.5 小腸組織勻漿TNF-α、IL-6與小腸黏液SIgA、小腸組織學評分之間的相關性 模型組小腸組織勻漿TNF-α、IL-6濃度與小腸黏液SIgA之間具有明顯的負相關(TNF-α:r=-0.953,P＜0.01;IL-6:r=-0.945,P＜0.01);與小腸組織學評分之間具有明顯的正相關(TNF-α:r=0.984,P＜0.01;IL-6:r=0.975,P＜0.01)。預處理組小腸組織勻漿TNF-α、IL-6濃度與小腸黏液SIgA之間具有明顯的負相關(TNF-α:r=-0.922,P＜0.01;IL-6:r=-0.907,P＜0.01);與小腸組織學評分之間具有明顯的正相關(TNF-α:r=0.986,P＜0.01;IL-6:r=0.960,P＜0.01)。

表1 9組大鼠小腸組織勻漿TNF-α,IL-6和黏液SIgA濃度測定值Tab.1 TNF-αand IL-6 level of in testinal tissue homogenate and SIgA content of intestinalmucus on 9 groups of rats±s

表1 9組大鼠小腸組織勻漿TNF-α,IL-6和黏液SIgA濃度測定值Tab.1 TNF-αand IL-6 level of in testinal tissue homogenate and SIgA content of intestinalmucus on 9 groups of rats±s

與假手術同時間點組比較,*1P＜0.01;與模型同時間點組比較,*2P＜0.05,*3P＜0.01Compared with sham-operated same time point group,*1P＜0.01;Compared withmodel same time point group,*2P＜0.05,*3P＜0.01

組別大鼠/只TNF-αIL-6 (pg·mL-1) SIgA/ (μg·mL-1)假手術6 h組12 176.65±6.82 198.41±11.27 101.58±3.99 12 h組12 175.98±7.05 195.17±15.75 103.83±5.73 24 h組12 177.57±9.66 203.30±16.87 104.45±5.87模型6 h組12 227.74±13.87*1456.84±38.53*187.31±5.89*112 h組12 318.00±16.71*1706.55±43.44*163.79±5.00*124 h組12 495.98±14.29*11 305.96±85.36*138.69±2.82*1預處理6 h組12 215.39±10.27*1*2414.16±37.34*1*287.26±4.45*112 h組12 281.20±8.20*1*3536.42±37.42*1*374.47±4.63*1*224 h組12 380.03±11.53*1*3781.01±44.82*1*359.45±3.37*1*3

A.假手術24 h組;B.模型24 h組;C.預處理24 h組圖1 假手術24 h組、模型24 h組、預處理24 h組小腸組織病理學切片圖(HE,×100)A.sham-operated 24 h group;B.model24 h group;C.pretreatment 24 h groupFig.1 Histopathology of intestinalmucosa in three groups of rats after 24 h(HE,×100)

表2 9組大鼠小腸病理學評分比較Tab.2 Com pares of histopathologic score on intestinal mucosa in 9 groups of rats 分,n=12,±s

表2 9組大鼠小腸病理學評分比較Tab.2 Com pares of histopathologic score on intestinal mucosa in 9 groups of rats 分,n=12,±s

與假手術組同時間點比較,*1P＜0.01;與模型組同時間點比較,*2P＜0.01Compared with sham-operated same time point group,*1P＜0.01;Compared with model same time point group,*2P＜0.01

組別評分組別評分假手術模型6 h組0.71±0.17 24 h組6.61±0.24*112 h組0.76±0.15預處量24 h組0.79±0.19 6 h組1.07±0.12*1模型 12 h組2.34±0.16*1*26 h組1.17±0.23*124組4.02±0.14*1*212 h組3.33±0.19*1

3 討論

免疫屏障是腸道黏膜屏障的重要組成部分。腸道免疫屏障主要依靠腸黏膜表面黏液及腸腔中的免疫球蛋白(以SIgA為主)和腸黏膜內以淋巴細胞為主的免疫活性細胞,來共同完成腸道的局部免疫防御功能[4-6],腸道SIgA在其中起核心作用。在本實驗中,模型組隨著造模時間的延長,腸黏液中SIgA分泌較假手術組明顯減少,說明腸黏膜免疫功能下降,免疫屏障受損。

SAP實質上是一種嚴重的全身炎癥反應綜合征(SIRS),大量的細胞因子釋放并相互激活,形成惡性循環,最終導致多臟器功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)的發生[7-10],成為SAP的主要死因。在眾多細胞因子中,TNF-α、IL-6與SAP全身并發癥的關系較為直接和肯定[11]。目前國內外文獻大多都是通過檢測血液中的細胞因子,來反映機體的炎癥反應情況。本研究通過檢測小腸組織勻漿中的細胞因子來反映局部組織的炎癥反應,實驗發現模型組大鼠小腸組織勻漿中TNF-α和IL-6水平較假手術組明顯升高,且隨病情進展有持續增高趨勢。在TNF-α、IL-6持續增高的同時,模型組小腸黏液中SIgA濃度隨著造模時間的延長呈持續下降趨勢,而小腸組織病理損傷評分持續升高。本研究對其進行線性相關分析。結果顯示:無論模型組還是預處理組,小腸組織勻漿TNF-α和IL-6水平與小腸黏液中SIgA濃度均呈明顯的負相關,而與小腸組織病理損傷評分呈正相關。提示SAP大鼠腸黏膜免疫屏障功能損傷與其產生的腸黏膜局部炎癥反應密切相關,SAP時腸黏膜免疫屏障損傷與局部TNF-α和IL-6水平的升高有關。

PAR-2是一種細胞膜表面受體,其具有蛋白酶受體家族特異的分子結構與激活方式,其分布于多種組織細胞中,參與多種病理生理過程,在炎癥反應過程中扮演重要角色[12-13]。FIORUCCI等[14]在三硝基苯磺酸誘導的小鼠結腸炎模型中,靜脈注射SLIGRL-NH2(一種PAR-2的特異性激活劑)后,發現小鼠結腸炎癥減輕,結腸黏膜組織損傷程度減輕,炎癥因子如IL-2、TNF-α明顯減少,提示PAR-2活化可能引發腸道保護機制。本研究在實驗時發現,預處理組在造模后各時點組,小腸組織勻漿TNF-α、IL-6濃度均比模型組顯著降低。證明SLIGKV-NH2可有效抑制機體局部組織促炎因子(TNF-α、IL-6)的過度釋放。MICHAEL等[15]研究表明在平滑肌、各種組織的內皮細胞、間質細胞和上皮細胞中均有明顯的PAR-2免疫反應性;全胃腸道均可見到PAR-2免疫標記,表明PAR-2廣泛分布于胃腸道。本研究前期實驗表明,在SAP大鼠中,PAR-2隨著模型時間延長,其表達逐漸上調,提示PAR-2可能作為小腸黏膜上皮細胞的保護性受體,在小腸黏膜受損后參與黏膜的修復機制。本研究在實驗時發現,預處理組在造模后各時組點,與模型組相比,小腸黏液SIgA水平明顯升高,小腸黏膜屏障各項指標均有不同程度好轉,且呈時間依賴性。證明SLIGKV-NH2對SAP腸黏膜免疫屏障有一定的保護作用。結合筆者之前發現的小腸組織勻漿TNF-α、IL-6水平升高與腸黏膜屏障各項指標的密切關系,因此SLIGKV-NH2可能是通過降低SAP大鼠血清TNF-α、IL-6水平,抑制炎癥因子的過度釋放而起到對腸黏膜屏障的保護作用。

此外,SLIGKV-NH2預處理后大鼠腸黏膜屏障各項指標雖有所改善,但與假手術組比較,腸黏膜屏障損傷仍有明顯加重,提示SLIGKV-NH2只在一定程度改善SAP大鼠腸黏膜屏障損傷程度,但不能完全阻斷SAP對腸黏膜屏障的損傷,原因可能是因為腸黏膜屏障損傷機制極為復雜,腸黏膜屏障的損傷和修復還存在其他機制的作用,這些需要進一步的研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.06.004

Effect of Protease Activated Receptor-2 Agonist on Intestinal SIgA in Rats with Acute Necrotizing Pancreatitis

XIA Liang1,ZENG Zhen-guo1,LIU Pi2,ZENG Hao2,ZHU Yong2,LV Nong-hua2
(1.Department of Critical Care Medicine;2.Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China)

ObjectiveTo discuss the effects of proteinase-activated receptor-2(PAR-2)agonists on intestinal SIgA levels in rats with severe acute necrotizing pancreatitis(SAP).MethodsThis study established SAP ratmodel and observed the levels of TNF-αand IL-6 in intestinal mucosa,SIgA content in intestinalmucus and histopathological changes of intestinal mucosa 6,12,and 24 h after establishment of model.The univariate analysis was used to compare the difference among groups. Linear correlation analysis was used to compare correlation between inflammatory mediators(TNF-α,IL-6)and SIgA content in intestinalmucus,as well as the histopathological scores of intestinal mucosa.ResultsThe level of TNF-αand IL-6 in intestinalmucosa and histopathological scores of intestinalmucosawere all significantly increased but SIgA contentwas decreased inmodel group at each time point after establishment of model,as compared with the sham-operated group(P＜0.05).The level of TNF-αand IL-6 in intestinalmucosa and histopathological scores of intestinalmucosa were all significantly decreased while SIgA content in intestinalmucus increased in pretreatmentgroup ateach time pointafter establishment of model,as compared with themodel group(P＜0.05).There was a positive relationship between inflammatory mediators(TNF-α,IL-6)in intestinal mucosa and histopathological scores of intestinal mucosa(P＜0.01).There was a negative relationship between inflammatory mediators(TNF-α,IL-6)and SIgA content in intestinal mucus(P＜0.05).ConclusionIntestinal mucosa immune barrier was impaired in the early stage of SAP in rats.PAR-2 agonist has therapeutic effects on intestinalmucosa immune barrier,which is related to the inhibition of excessive release of inflammatory mediators(TNF-αand IL-6)in rats with SAP.

Proteinase-activated receptor-2 agonists;Pancreatitis,acute,severe;Intestinal mucosa barrier;Secretory immunglobulin A(SIgA);Tumor necrosis factor alpha;Interleukin-6

R576;R965

A

1004-0781(2014)06-0707-06

2013-08-19

2013-10-20

*江西省青年科學基金項目(20114BAB215050);黎介壽院士腸道屏障研究專項基金(2012年度)

夏亮(1979-),男,江西南昌人,主治醫師,博士,研究方向:急性胰腺炎的基礎與臨床。電話:0791-88692541,E-mail:liangx96180@126.com。

呂農華(1954-),女,江西南昌人,教授,博士生導師,主要從事消化疾病研究。電話:0791-88692541,E-mail:lunonghua@163.com。