川芎嗪對咖啡因引起的PC12細胞損傷的保護作用*

王佳,高峰,張春兵

(江蘇省中醫院檢驗科,南京 210029)

·藥物研究·

川芎嗪對咖啡因引起的PC12細胞損傷的保護作用*

王佳,高峰,張春兵

(江蘇省中醫院檢驗科,南京 210029)

目的 分析川芎嗪對咖啡因引起大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤克隆化細胞株PC12細胞損傷的保護作用,探討川芎嗪治療腦缺血-再灌注損傷的機制。方法制備咖啡因細胞損傷模型,通過CCK-8法活細胞檢測、流式細胞術線粒體膜電位測定、Western-blot檢測高遷移率族蛋白B1(HMGB1)、酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測氧化應激指標觀察咖啡因的毒性及川芎嗪的保護作用。結果川芎嗪預處理后,PC12細胞的存活數顯著提高,細胞線粒體膜電位提高,HMGB1表達顯著降低,超氧化物歧化酶(SOD)上調,乳酸脫氫酶(LDH)和丙二醛(MDA)下調,谷胱甘肽(GSH)升高。結論川芎嗪對咖啡因引起的PC12細胞損傷有顯著的保護作用,其保護作用可能與川芎嗪抑制細胞凋亡、調節炎癥性遞質表達水平及氧化應激反應相關。

川芎嗪;PC12細胞;損傷,腦缺血-再灌注

腦缺血-再灌注損傷是多種機制參與的一種復雜的病理生理過程,多種環節因素之間互相作用。抑制腦缺血-再灌注損傷是目前有效治療腦卒中的關鍵。鈣超載是導致神經細胞死亡的“最后共同通路”[1-2]。細胞內游離鈣的增加通常是細胞外鈣的內流或細胞內鈣庫釋放所致,咖啡因是興奮中樞神經系統最常用的一種黃嘌呤制劑,作為細胞肌漿網里阿諾堿受體(ryanodine receptor)的激動藥,能引發對ryanodine敏感的鈣庫釋放[3],常被用于制備神經元鈣離子超載模型[4]。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)能減輕腦缺血-再灌注損傷程度,具有顯著的缺血后腦保護作用,前期研究以及其他實驗報道,川芎嗪可以穿透血-腦脊液屏障,降低缺血-再灌注損傷區神經元的凋亡[5-7]。大鼠嗜鉻細胞瘤細胞株PC12表達神經生長因子受體,可誘導產生神經表型,廣泛用于神經系統疾病的體外研究。筆者在本研究擬以PC12細胞為對象,制備咖啡因細胞損傷模型,觀察不同濃度川芎嗪對PC12細胞的保護作用,探討川芎嗪降低咖啡因毒性的可能機制,進而明確川芎嗪減輕腦缺血-再灌注損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試藥 鹽酸川芎嗪注射液(江蘇無錫市第七制藥廠,批號:012014,規格:2 mL∶40 mg);胎牛血清、馬血清、達爾伯克改良伊格爾培養基(dulbecco's modified eagle'smedium,DMEM)培養液(新西蘭Gibco公司,批號:1255136);咖啡因(美國Sigma公司,批號:C7050);明膠(美國Sigma公司,批號:G9382);CCK-8試劑盒(日本Dojindo公司,批號:CK04-1000T);胰蛋白酶(美國Difco公司,進口分裝);羅丹明(美國Invitrogen公司,批號:14521-80-3);mouse-anti-Rat HMGB1和mouse-anti-Rat actin(英國Abcam公司,批號:ab77302、ab6276);丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、硝酸纖維素膜(美國Amersham Bioscience公司);Enhanced Chemiluminescent試劑盒(美國Pierce公司,批號: 34095);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙二醛(malonaldehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)和氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized,GSSG)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:A001-1、A020-3、A003-1、A006-1、A061-2)。

1.2 細胞PC12細胞 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞克隆株PC12細胞,購自上海中國科學院細胞庫。

1.3 儀器 流式細胞儀(美國Becton Dickinson);酶標儀3350、洗板機1575、蛋白質電泳儀、蛋白質轉膜儀(美國Bio-Rad);凝膠成像分析儀、圖像分析儀(上海天能科技有限公司)。

1.4 細胞培養與藥物作用

1.4.1 培養及傳代 PC12細胞疏松貼壁生長,完全培養液是含10%滅活胎牛血清和10%滅活馬血清的高糖DMEM培養液,葡萄糖溶液濃度4.5 g·L-1, pH7.4。培養于含5%二氧化碳(CO2)的37℃細胞培養箱。0.1%明膠預先包被細胞培養瓶,備用。在細胞培養瓶中70%單層后傳代,吸去舊培養液,加入新的培養液,用吸管吹下細胞,用移液器把細胞吹散,以1∶4的比例傳至新細胞培養瓶中,2 d后半量換液。

1.4.2 咖啡因模型建立 0.25%胰酶消化細胞培養瓶單層細胞,制備成單細胞懸液,計數,接種到96孔細胞培養板中,每孔105個,完全培養液100μL,隔天換培養液,生長至單層。加入5 mmol·L-1咖啡因,孵育24 h后,輕輕去除培養液;換上不含咖啡因的新鮮培養液培養,每種濃度皆復孔培養[4]。

1.4.3 川芎嗪保護實驗 0.9%氯化鈉溶液配置成川芎嗪0,0.1,1,10 mmol·L-14個濃度,預處理PC12細胞,孵育60 min后,輕輕去除培養液;洗滌后,換液,并加入5 mmol·L-1咖啡因,孵育24 h后,輕輕去除培養液;換上不含咖啡因的新鮮培養液培養,每種濃度皆復孔培養。

1.5 觀察指標

1.5.1 CCK-8法檢測細胞毒性 培養結束后,每孔(包括空白孔)中加入CCK-8溶液10μL,37℃孵育2 h,酶標儀測定450 nm波長處的吸光度值(A值)。細胞活力(%)=(A加藥-A空白)/(A未加藥-A空白)×100%。A加藥指具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的A值,A空白指具有完全培養液和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的A值,A未加藥指具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的A值。

1.5.2 流式細胞術觀察細胞線粒體膜電位 0.25%胰酶消化PC12細胞形成單細胞懸液,接種96孔細胞培養板中,每孔100μL含細胞105個,加入羅丹明123染液5μg·mL-1;細胞培養箱(37℃,5%CO2)孵育15 min;完全培養基洗細胞2次;重懸細胞于培養液中,細胞培養箱(37℃,5%CO2)孵育60 min;流式細胞儀檢測:激發波長488 nm,發射波長530 nm。

1.5.3 Western-blot檢測高遷移率族蛋白B1(high mobility group box chromosomal protein 1,HMGB1)

1.5.3.1 提取細胞核蛋白及濃度測定 細胞核蛋白提取按照試劑盒說明書進行,核蛋白濃度測定采用Bradford法,以0.5 mg·m L-1半血清清蛋白(BSA)作為標準蛋白。

1.5.3.2 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacryl amide gelel ectrophoresis,SDS-PAGE)和轉膜 核蛋白提取液變性后SDS-PAGE,以預染蛋白分子量Marker取得HMGB1的位置。濾紙、硝酸素纖維膜、凝膠等在轉膜緩沖液中浸泡10 min后按順序安裝。恒壓100 V濕轉65 min。取出硝酸素纖維膜。5%脫脂奶粉溶液37℃封閉2 h。

1.5.3.3 雜交和顯影 抗HMGB1和抗β-actin分別以1∶2 000和1∶5 000稀釋于1%脫脂奶粉溶液中,4℃孵育過夜。0.5%PBST(磷酸鹽緩沖液1 000 mL+5 mL聚山梨酯20)洗膜5次,每次10 min。辣根過氧化物酶標記goat-anti-mouse抗體以1∶5 000稀釋于1%脫脂奶粉溶液中,37℃孵育1 h。0.5%PBST洗膜5次,每次10 min。Pierce公司的增強化學發光試劑盒(enhanced chemiluminescent)A液1 mL,B液1 m L,混勻,漂洗硝酸素纖維膜。

1.5.3.4 圖像分析 將各測量組的電泳照片掃描至計算機,然后應用Bandscan分析軟件對電泳條帶進行灰度測定,并計算平均A值。

1.5.4 氧化應激指標(SOD、MDA、LDH、GSH和GSSG)觀察 收集細胞,重懸,800×g離心10 min,棄去上清液,留沉淀,加入0.9%氯化鈉溶液150μL,在冰浴中手動勻漿3 min,取勻漿液25μL測定。檢測方法按試劑盒方法進行。

1.6 統計學方法 應用SPSS10.0版統計軟件進行分析,數據以均數±標準差(±s)表示。采用方差分析(analysis of variance,ANOVA)比較多個樣本之間的均數,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 川芎嗪降低咖啡因神經細胞毒性 咖啡因具有細胞毒性。應用不同濃度的川芎嗪處理咖啡因(5 mmol·L-1)PC12細胞模型,川芎嗪呈劑量依賴性地提高細胞存活率,降低咖啡因神經細胞毒性。見圖1。

2.2 川芎嗪拮抗咖啡因破壞線粒體膜電位 咖啡因模型組,可見熒光顯著增強,表明線粒體膜電位下降;而經過川芎嗪預處理后,熒光強度減弱,且亦可觀察到劑量依賴性,表明川芎嗪可以劑量依賴性地提高線粒體膜電位。見圖2。

與0 mmol·L-1川芎嗪組比較,*1P＜0.05圖1 不同濃度川芎嗪干預后的咖啡因處理細胞存活率Compared with 0 mmol·L-1TMP group,*1P＜0.05Fig.1 Survival rate of cells treated with caffeine after pretreatmentwith different concentration of TMP

紅線:0mmol·L-1川芎嗪+0μmol·L-1咖啡因;綠線: 0 mmol·L-1川芎嗪+5 mmol·L-1咖啡因;藍線:0.1 mmol·L-1川芎嗪+5 mmol·L-1咖啡因;黑線:1 mmol·L-1川芎嗪+ 5mmol·L-1咖啡因;紫線:10 mmol·L-1川芎嗪+5 mmol·L-1咖啡因圖2 川芎嗪對咖啡因降低線粒體膜電位的拮抗作用Red line:0 mmol·L-1TMP+0μmol·L-1caffeine;Green line:0 mmol·L-1TMP+5 mmol·L-1caffeine;Blue line: 0.1 mmol·L-1TMP+5 mmol·L-1caffeine;Black line: 1 mmol·L-1TMP+5 mmol·L-1caffeine;Purple line: 10mmol·L-1TMP+5mmol·L-1caffeineFig.2 Antagonism of TMP on the reduction of mitochondrialm embrane potential by caffeine

2.3 川芎嗪調控核蛋白HMGB1 在蛋白質相對分子質量分別是29 000和45 000處有表達條帶,分別是HMGB1和β-actin蛋白表達。陰性對照組HMGB1表達為(2.6±0.6),5 mmol·L-1咖啡因模型組HMGB1表達為(123.1±9.2),與陰性對照組比較,差異有統計學意義(P＜0.05),1 mmol·L-1川芎嗪預處理后, HMGB1表達顯著降低,為(91.7±8.7),與模型組比較,差異有統計學意義(P＜0.05)。

2.4 川芎嗪調控咖啡因模型組氧化應激反應 咖啡因模型組SOD降低,LDH和MDA上升,GSH降低, GSH/GSSG降低;川芎嗪預處理組SOD上調,LDH和MDA下調,GSH升高,上調GSH/GSSG比值。見表1。

3 討論

腦缺血-再灌注損傷是多種機制參與的一種復雜病理生理過程,主要與自由基過度形成、興奮性氨基酸毒性作用、細胞內鈣超載、炎性反應等多種機制有關,多種環節因素之間互相作用,進一步促進腦缺血-再灌注損傷后的神經功能破壞、腦梗死灶形成。腦缺血-再灌注損傷后通常出現神經細胞死亡和遲發性神經細胞死亡兩種形式,后者是一種細胞主動性死亡,稱之為凋亡,是腦缺血-再灌注損傷的最重要形式。

線粒體跨膜電位的降低是細胞凋亡早期的不可逆事件,線粒體是多種促細胞凋亡信號轉導分子的靶點,同時也是細胞死亡通路的整合元件,在各種促細胞凋亡信號作用下,線粒體通透性轉運孔不可逆過度開放,導致線粒體跨膜電位崩解,呼吸鏈解耦聯,線粒體基質滲透壓升高,內膜腫脹,釋放出膜間促凋亡蛋白,最終引起細胞凋亡。在多數條件下,線粒體內鈣離子的過度聚積可使膜通透性轉運孔開放,引起線粒體功能障礙,啟動神經元的死亡和凋亡[8]。而咖啡因作為細胞肌漿網理阿諾堿受體的激動藥,能引發鈣庫釋放[3],筆者觀察到咖啡因模型組,線粒體膜電位下降,而川芎嗪可抑制鈣的超載,提高線粒體膜電位,抑制細胞凋亡。

早期對HMGB1的研究主要是作為一種重要的晚期炎癥遞質介導膿毒癥的病理過程,此作用依賴于IL-13介導的JAK/STAT信號通路。HMGB1還參與自身免疫性疾病(如關節炎等)、腫瘤、缺血-再灌注損傷等多種非感染性炎癥疾病的病理過程。此外,HMGB1具有抗凋亡作用,p53/HMGB1復合物可以調節腫瘤細胞的自噬和凋亡,介導腫瘤細胞自噬[9]。咖啡因致損傷模型中,HMGB1高表達,提示咖啡因致細胞受損過程中HMGB1主要起炎癥因子而非抗凋亡。有研究顯示在肝臟缺血-再灌注損傷可以檢測到HMGB1,并且阻斷HMGB1可以改善肝臟損害[10]。咖啡因致損傷模型中,觀察到川芎嗪下調HMGB1的表達,提示川芎嗪的保護效應與炎癥性遞質相關。

表1 不同濃度川芎嗪對咖啡因模型組氧化應激反應的影響Tab.1 Effect of different concentration of TMP on oxidative stress of caffeine group±s

表1 不同濃度川芎嗪對咖啡因模型組氧化應激反應的影響Tab.1 Effect of different concentration of TMP on oxidative stress of caffeine group±s

0組:0mmol·L-1川芎嗪+0μmol·L-1咖啡因;1組:0 mmol·L-1川芎嗪+5 mmol·L-1咖啡因;2組:0.1 mmol·L-1川芎嗪+ 5mmol·L-1咖啡因;3組:1 mmol·L-1川芎嗪+5 mmol·L-1咖啡因;4組:10 mmol·L-1川芎嗪+5 mmol·L-1咖啡因;與0組比較,*1P＜0.05;與1組比較,*2P＜0.05Group 0:0 mmol·L-1TMP+0μmol·L-1caffeine;Group 1:0 mmol·L-1TMP+5 mmol·L-1caffeine;Group 2:0.1 mmol·L-1TMP+ 5mmol·L-1caffeine;Group 3:1 mmol·L-1TMP+5 mmol·L-1caffeine;Group 4:10 mmol·L-1TMP+5 mmol·L-1caffeine;Compared with group 0,*1P＜0.05;Compared with group 1,*2P＜0.05

組別例數SOD/ (U·mg-1) LDH/ (U·g-1) MDA/ (pmol·L-1) GSH GSSG (mg·g-1) 0 10 142.3±5.2 90.1±2.1 1.76±0.41 58.2±2.1 4.9±0.7 1 10 93.5±4.7*1162.4±5.2*12.96±0.58*129.7±2.8*14.3±0.9*12 10 112.4±3.7*2142.7±4.2*22.72±0.47 35.7±4.3*23.8±0.4 3 10 128.5±3.1*2123.5±3.7*22.62±0.52*238.7±2.8*23.9±0.6 4 10 131.7±4.1*2114.3±5.7*22.35±0.71*243.1±1.9*24.1±0.2*2

在正常機體內,活細胞可以從不同來源持續產生自由基,如線粒體從電子傳遞鏈釋放自由基,信號轉導劑氧化亞氮等形成活性的亞硝基自由基,氧化還原反應中活化的金屬通過Fenton反應和Haber-Weiss反應產生自由基,當種種原因導致體內過氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)、過氧自由基(O2-)等各種活性氧化物(reactive oxygen species,ROS)超過機體內源性的抗氧化能力,則引起機體內氧化/抗氧化系統平衡失調,發生氧化應激損傷。多方面的神經病理學研究顯示,神經退行性疾病的發生與供體的氧化產物水平增加有密切關系,因為腦和神經內含有大量的脂質、耗氧量較高,而神經元不能分裂,所以ROS蓄積引起的損傷有可能是疾病發生發展的重要誘因[11]。氧化應激指標的變化提示可能是咖啡因引起鈣離子超載,從而導致能量耗竭產生大量氧自由基。這些氧自由基引發了氧化應激指標的改變,以至脂質過氧化損傷。而川芎嗪可能通過某種途徑抑制鈣的超載,調節氧化應激反應,抑制脂質過氧化損傷。

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DOI 10.3870/yydb.2014.06.001

Protective Effect of Tetramethylpyrazine on Caffeine-induced PC12 Cell Injury

WANG Jia,GAO Feng,ZHANG Chun-bing
(1.Department of Clinical Laboratory,Jiangsu Province Hospital of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210029,China)

ObjectiveTo analyze whether tetramethylpyrazine could protect PC12 cells from injuries induced by caffeine,and to explore themechanism of tetramethyipyrazine in the treatment of cerebral ischemia-reperfusion injury.MethodsCaffeine was added to induce apoptosis of PC12 cells.Cytotoxicity was detected by CCK-8 assay.The electric potential of mitochondrialmembrane was determined by flow cytometry.HMGB1 was detected by Western blotting.Oxidative stress was detected by ELISA.We observed toxicity of caffeine and the protective effects of tetramethylpyrazine.ResultsAfter the pretreatment,tetramethylpyrazine significantly improved PC12 cell survival.Mitochondrial membrane potential was increased,the expression of HMGB1 decreased,SOD increased,LDH and MDA decreased,and GSH elevated.ConclusionTetramethylpyrazine exerts a significant protective effect on PC12 cell injury caused by caffeine.The protective effectmay be related to inhibition of apoptosis and regulation of the expression level of mediators involved in inflammation and oxidative stress.

Tetramethylpyrazine;PC12 cells;Injury,cerebral ischemia-reperfusion

R965

A

1004-0781(2014)06-0695-04

2013-06-13

2013-08-24

*江蘇省自然科學基金資助項目(BE2010768);國家自然科學基金資助項目(81171659)

王佳(1980-),女,江蘇常州人,主管技師,碩士,研究方向:醫學免疫學。電話:025-86617141-90306,E-mail:gaof_1218@163.com。

張春兵(1969-),男,江蘇鹽城人,主任技師,博士,研究方向:醫學免疫學。電話:025-86617141-90306,E-mail:chbingzh@163.com。