煙草GA代謝相關基因ga1和ga2的克隆和表達分析

丁安明，陳雅瓊，Zahid Hussain，康 樂，張蘊睿，崔萌萌，王 倩，孫玉合*

?

煙草GA代謝相關基因和的克隆和表達分析

丁安明1,2，陳雅瓊1,2，Zahid Hussain1,2，康 樂1,2，張蘊睿1,2，崔萌萌1，王 倩1，孫玉合1*

（1.中國農業科學院煙草研究所，煙草行業煙草基因資源利用重點實驗室，青島 266100；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

為了解赤霉素（gibberellic acids, GA）在煙草生長發育中的作用，本研究利用同源克隆和RACE技術分離了3個煙草種GA代謝相關基因和的6條序列，對其進行了序列比對和進化分析；并利用熒光定量表達分析研究了其在林煙草和普通煙草中的表達譜。結果表明，相關基因在煙草屬和茄科作物中保守性很高；普通煙草中克隆的和可能起源于絨毛狀煙草。表達分析表明，和在林煙草生長發育早期和莖伸長期分別在葉和莖中的表達量顯著高于其他組織。

煙草；赤霉素；熒光定量表達分析

赤霉素（gibberellic acids, GA）是調節植物生長發育的一類重要的二萜類激素，作用于植物整個生命周期，包括種子萌發、莖的伸長、開花誘導、花藥發育及種子和果實的生長等[1-2]。目前，植物中GA的代謝途徑已經基本確定，由C20前體牻牛兒牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl diphoaphate, GGDP）經一系列酶催化生成[3]。該代謝途徑的第一步和第二步催化反應在植物葉綠體內完成，由古巴焦磷酸合酶（ent-copalyl pyrophosphate synthase, CPS）和內根-貝殼杉烯合酶（ent-kaurene synthase, KS）催化GGDP形成內根-貝殼杉烯。編碼CPS和KS兩種酶的基因分別為和，并已在擬南芥、水稻、豌豆等植物中進行了克隆和功能驗證分析[4-8]。Sun等[5]從擬南芥野生型分離了全長cDNA，證實該基因的產物為CPS，并用35S標記將該酶定位于葉綠體。Yamaguchi等[6]利用擬南芥矮化突變體及已克隆的南瓜cDNA做同源探針，克隆了該基因并通過放射性標記酶底物證實了其功能。Fleet等[8]對擬南芥和分別和同時進行過表達分析，并檢測了基因直接產物CPS、KS及植株中的GA含量，發現雖然CPS和KS的含量大大升高，但擬南芥植株表型和GA含量均沒有明顯變化，從而推測GA合成的限速步驟在后續的催化反應。

Ishida等[9]利用來自擬南芥的兼并引物和RT-PCR獲得了普通煙草和等基因的部分序列。作為重要的模式植物和經濟作物，目前煙草和基因尚未被克隆，其在煙草生長發育中的作用也有待探討。本研究分離了煙草和基因，分析了其進化關系和表達特性，為研究其在煙草生長發育中的功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為普通煙草品種K326和野生二倍體林煙草、絨毛狀煙草，2012年播種于溫室，自然條件下培養至生殖生長期。分別采集營養生長期的根、莖、葉和生殖生長期的花芽、花。

1.2 基因克隆

使用GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit（Thermo）提取各組織總RNA。采用PrimeScriptTMRT-PCR Kit（Takara）反轉錄第一鏈cDNA，作為PCR擴增的模板。檢索本氏煙草基因組(http://solgenomics.net/organism/Nicotiana_benthamiana/genome)預測的cDNA數據庫，得到本氏煙草和基因全長CDS，并據其進行相關基因的引物設計（表1），用于擴增二倍體煙草和普通煙草和基因的中間片段。PCR擴增條件參照文獻[10]。將PCR產物檢測回收，連接pmd18-T載體后轉化大腸桿菌感受態DH5ɑ。篩選陽性克隆，并送華大基因公司測序。

采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech）分別進行3’和5’ RACE反應。所用基因特異引物GSP和巢式引物NGSP根據測序中間片段序列設計（表1），反應條件參照文獻[10]。將RACE產物測序和拼接得到全長cDNA序列。

1.3 多序列比對、系統進化和亞細胞定位分析

采用DNAMAN軟件將得到的煙草和基因與番茄等進行多序列比對分析；利用MEGA 5.0[11]構建NJ進化樹。采用在線程序TargetP[12]對煙草和進行亞細胞定位預測。

表1 絨毛狀煙草基因克隆和表達分析的引物及其序列

1.4 熒光定量表達分析

分別提取K326和林煙草不同生長時期各組織的總RNA，去除基因組DNA污染后，稀釋到100 ng/μL。按照試劑盒說明，利用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time, Takara）將總RNA反轉錄為cDNA，稀釋5倍后利用SYBR?Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus, Takara）在熒光定量PCR儀ABI 7500上進行qRT-PCR分析。所用基因特異引物見表1，以煙草核糖體蛋白基因作為內參[10,13]。

2 結 果

2.1 煙草ga1和ga2基因的分離

利用本氏煙草來源的引物，在普通煙草、絨毛狀煙草和林煙草中都得到了約1300 bp的中間片段，并且利用RACE技術分別獲得了和基因在3個煙草種中的全長CDS序列。圖1顯示在絨毛狀煙草中獲得的RACE結果。

基因5’ RACE獲得了約650 bp的條帶；巢式擴增得到一條508 bp的序列；3’ RACE擴增得到了1103 bp的序列。根據序列重疊并去除RACE反應加入的接頭序列后，得到了絨毛狀煙草包括UTR全長2836 bp的序列，其中5’ UTR和3’ UTR分別長178 bp和168 bp，編碼區長2490 bp，編碼829個氨基酸的蛋白質。同樣的方法得到了絨毛狀煙草包括UTR全長2852 bp的序列，其中5’ UTR和3’ UTR分別長208 bp和343 bp，編碼區長2301 bp，編碼769個氨基酸的蛋白質。將本氏煙草中預測的基因命名為/，本實驗克隆的普通煙草、絨毛狀煙草和林煙草的6條序列分別命名為/、/和/（表2）。

圖1 絨毛狀煙草ga1和ga2基因RACE擴增結果

注：M為DL2000分子量標準；1為5’ RACE擴增結果；2為5’ RACE巢式擴增結果；3為3’ RACE擴增結果。

表2 煙草ga1和ga2基因的序列信息

2.2 多序列比對和亞細胞定位分析

將得到的煙草屬序列與番茄相應基因編碼的蛋白序列進行了多序列比對（圖2）。較茄科作物番茄，ga1和ga2在煙草屬不同種之間保守性很高。在線程序TargetP預測結果表明，煙草ga1和ga2均具有葉綠體定位序列，成熟蛋白定位于葉綠體，參與赤霉素在葉綠體中的合成反應（表2）。

2.3 系統進化分析

Lee等[14]認為普通煙草起源于野生二倍體絨毛狀煙草和林煙草，其天然雜交F1經染色體自然加倍成為四倍體煙草。進化樹分析顯示（圖3），普通四倍體煙草和與絨毛狀煙草親緣關系最近，而與林煙草相對較遠。其他植物，如番茄、擬南芥、水稻等中均存在其直系同源基因。

注：相同的氨基酸以黑色表示；相似的氨基酸以灰色表示。

圖3 煙草、番茄、擬南芥和水稻ga1和ga2的進化分析

2.4 熒光定量表達分析

熒光定量表達分析表明（圖4），和在K326和林煙草被檢測的組織中均有表達，但表達量在不同組織存在明顯差異。二者在林煙草莖伸長前期的葉片中表達量最高；而在莖伸長期時在莖中的表達量顯著高于根和葉；在生殖生長期的花芽中的表達量略高于花。在K326中，在營養生長期的莖表達量最高，而在根中表達量最高。

3 討 論

在葉綠體中，ga1和ga2催化的合成反應是赤霉素代謝的必經途徑，其發生突變最直接的表型是植株矮化[5-6]。這種作用在以農作物如小麥、水稻等矮化育種為主導的第二次綠色革命中起到了重要作用[1,15-19]。煙草作為重要的模式植物，其相關基因的研究鮮有報道。本研究利用同源克隆和RACE技術，獲得了煙草屬3個種和基因類似物的全長CDS序列，包括普通煙草及其可能的起源種絨毛狀煙草和林煙草。序列比對發現，本研究獲得的煙草和類似物的序列與Ishida等[9]獲得的普通煙草和的部分序列基本一致，說明本研究獲得了幾種煙草的相關基因序列。

圖4 煙草ga1和ga2在林煙草和普通煙草K326中的熒光定量表達分析

注：a和b分別為（上）和（下）在林煙草和普通煙草K326中的相對表達量。a（1~8）分別為林煙草莖伸長前期的根（1）、莖（2）、葉（3）；莖伸長期的根（4）、莖（5）、葉（6）；生殖生長期的花芽（7）、花（8）。b（1~5）分別為普通煙草K326營養生長期的根（1）、莖（2）、葉（3）；生殖生長期的花芽（4）、花（5）。

通過構建系統進化樹，可以分析分子間的起源關系。通常認為，普通煙草由野生二倍體絨毛狀煙草和林煙草的天然雜交F1經染色體加倍形成[14,20]。由此，可以推測普通煙草較野生二倍體煙草存在和基因的二份拷貝，一個起源于絨毛狀煙草，一個起源于林煙草。Prisic等[21]研究證實，水稻中存在兩個CPS編碼基因，但其功能已經發生了分化，一個參與赤霉素合成，另一個則參與次級代謝，生成具有防御功能的化學物質。本實驗中，在普通煙草K326中克隆了兩個基因的各一個拷貝，且其與絨毛狀煙草中相應基因的親緣關系最近。作者推測，普通煙草中可能還存在起源于林煙草的基因拷貝或者同源物，這份冗余的拷貝是否在進化中丟失了功能或者行使不同于赤霉素合成的功能，有待于進一步鑒定。

林煙草較普通煙草和絨毛狀煙草在植株生長發育中存在較大差異。林煙草在生長發育早期呈“匍匐狀”，即莖不伸長，到營養生長后期和生殖生長前期，其莖開始生長；而普通煙草和絨毛狀煙草的生長發育一直伴隨著莖的伸長。推測可能與GA代謝相關。因此，本研究對林煙草和普通煙草和基因進行了不同發育時期的熒光定量表達分析。結果表明，在林煙草生長發育早期其主要在葉片中表達，在莖伸長期莖中的表達量則顯著高于根和葉片。已知GA的一個生理效應是能加速細胞伸長，從而促進植物的營養生長，尤其能顯著促進莖和葉的生長。林煙草生長發育早期莖不伸長，主要是葉片的生長；到營養生長后期和生殖生長前期則主要是莖的伸長。這與GA代謝基因在林煙草不同發育階段不同組織器官中的表達量基本一致。

進一步研究可以繼續篩選普通煙草中起源于林煙草和基因的直系同源序列，分析序列和功能其是否已發生變化；結合RNAi、過表達和原核表達等技術研究其在煙草中的功能。

4 結 論

本研究利用RACE技術從3個煙草種中克隆了GA合成相關基因和，均被預測定位于葉綠體；序列比對發現煙草屬中相關基因高度保守；進化樹分析顯示，普通煙草中克隆的和可能來源于絨毛狀煙草；表達分析表明，相關基因的表達與林煙草的生長發育狀態基本一致。

[1] Silverstone A L, Sun T P. Gibberellins and the green revolution[J]. Trends in plant science, 2000(5): 1-2.

[2] MacMillan J. Occurrence of gibberellins in vascular plants, fungi, and bacteria[J]. Plant Growth Regul, 2002, 20: 387-442.

[3] Yamaguchi S. Gibberellin metablism and its regulation[J]. Annu. Rev. Plant Biol, 2008, 59: 225-251.

[4] Sun T P, Goodman H M, Ausubel F M. Cloning the arabidopsis GA1 locus by genomic subtraction[J]. The Plant Cell, 1992(4): 119-128.

[5] Sun T P, Kamiya Y. The arabidopsis GA1 locus encodes the entcopalyl pyrophosphate synthase of gibberellin biosynthesis[J]. The Plant Cell, 1994(6): 1509-1518.

[6] Yamaguchi S, Sun T P, Kawaide H, et al. The GA2 Locus of arabidopsis thaliana encodes ent-kaurene synthase of gibberellin biosynthesis[J]. Plant physiol, 1998, 116: 1271-1278

[7] Helliwell C H, Sulivan J A, Mould R M, et al. A plasmid envelope location of arabidopsis ent-Kaurene oxidase links the plastid and endoplasmic reticulum steps of the gibberellin biosynthesis pathway[J]. The Plant Journal, 2001(28): 201-208.

[8] Fleet C M, Yamaguchi S, Hanada A, et al. Overexpression of AtCPS and AtKS in Arabidopsis confers increased ent-Kaurene production but no increase in bioactive gibberellins[J]. Plant Physiology, 2004, 132: 830-839.

[9] Ishida S, Fufazawa J, Yuasa T, et al. Involvement of 14-3-3 signaling protein binding in the functional regulation of the transcriptional activator repression of shoot growth by gibberellins[J]. The Plant Cell, 2004(16): 2641-2651.

[10] 太帥帥，劉貫山，孫玉合，等. 普通煙草CDPK 基因家族的克隆及表達分析[J]. 中國農業科學，2009，42（10）：3600-3608.

[11] Tamura K, Peterson D, Peterson N, et al. MEGA5, molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution, 2010, 28: 2731-2739.

[12] Emanuelsson O, Nielsen H, Brunak S, et al. Predicting subcecullar localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence[J]. J Mol Biol, 2000, 300: 1005-1016.

[13] Schmidt G W, Delaney S K. Stable internal reference genes for normalization of real-time RT-PCR in tobacco () during development and abiotic stress[J]. Mol Genet Genomics, 2010, 183: 233-241.

[14] Lee K Y, Townsend J, Tepperman J, et al. The molecular basis of sulfonylurea herbicide resistance in tobacco [J]. The EMBO Journal, 1988(7): 1241-1248.

[15] Rebetzke G J, Richards R A. Gibberellic acid-sensitive dwarfing genes reduce plant height to increase kernel number and grain yield of wheat[J]. Aust J Agric Res, 2000, 51: 235-245.

[16] 傅大雄，阮仁武，劉大軍，等. 近等基因系法對小麥顯性矮源的研究[J]. 中國農業科學，2007，40（4）：655-664.

[17] 楊松杰，張曉科，何中虎，等. 用STS標記檢測矮稈基因和在中國小麥中的分布[J]. 中國農業科學，2006，39（8）：1680-1688.

[18] Khush D, Gurdev S. Breaking the yield frontier of rice[J]. Geo Journal, 1995, 35 : 329-332.

[19] 劉傳光，張桂權，周漢欽，等. 華南地區常規秈稻品種產量和株型性狀的遺傳改良[J]. 中國農業科學，2010，43（19）：3901-3911.

[20] 王元英. 煙草基因組知識篇：1. 基因組與煙草基因組計劃[J]. 中國煙草科學，2010，31（1）：81-82.

[21] Prisic S, Xu M M, Wilderman P R, et al. Rice contains two disparate ent-copalyl diphosphate synthases with distinct metabolic functions[J]. Plant Physiology, 2004, 136: 4228-4236.

Cloning and Expression Analysis ofandin Tobacco

DING Anming1,2, CHEN Yaqiong1,2, Zahid Hussain1,2, KANG Le1,2, ZHANG Yunrui1,2, CUI Mengmeng1, WANG Qian1, SUN Yuhe1*

(1. Key laboratory for tobacco gene resources, Tobacco Research Institute of CAAS, Qingdao 266100, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

Two GA metabolism related genesandwere cloned by using homology-based method and RACE from three tobacco species to explore the role in which gibberellic acids (GA) play in tobacco growth and development. Based on sequence alignment, a phylogenetic tree was constructed. qRT-PCR was executed to detect the gene expression profiles inand. The results showed that they were highly conserved in sequences inplants and genes inmight originate from. qRT-PCR analysis showed thatandwere expressed in much higher levels in leaves of stage before stem elongation and in stem of the stem elongation stage than other tissues in.

tobacco; gibberellic acid; qRT-PCR

TS413

1007-5119（2014）01-0102-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.019

丁安明，男，博士研究生，主要從事煙草功能基因組學研究。E-mail：anmingdsdau@163.com。

通信作者，E-mail：yhsun@163.com

2013-06-06

2013-11-14