不同種植方式下烤煙根系差異表達蛋白質分析

尤垂淮，陳冬梅，黃錦文，唐莉娜，徐志兵，張重義，林文雄*

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不同種植方式下烤煙根系差異表達蛋白質分析

尤垂淮1,2，陳冬梅1,2，黃錦文1，唐莉娜3，徐志兵1,2，張重義1,2，林文雄1,2*

（1.福建農林大學農業生態研究所，福州 350002；2.福建農林大學煙草研究所，福州 350002；3.福建省煙草專賣局煙草農業科學研究所，福州 350003）

通過根系差異蛋白質組學探討了種植方式（復種連作、復種輪作）對烤煙生長的影響。結果表明，共有15個蛋白質表達豐度發生變化，用LC-MS/MS鑒定了14個差異蛋白質點，經生物信息學分析，11個蛋白質的功能有注釋，其中3個屬于與香氣形成有關的蛋白質，包括轉酮醇酶、單脫氫抗壞血還原酶和O-甲基轉移酶，它們在復種輪作條件下均上調表達，此可能有助于煙葉品質提高，而復種連作處理下調表達，可能不利于品質提高。還鑒定到涉及能量、抗性、物質運輸、核酸等功能的蛋白：磷酸甘油酸酯激酶、線粒體內膜移位酶亞基Tim13、NBS-LRR、DnaJ、細胞內囊泡運輸蛋白Sly1、核糖體蛋白質，在復種輪作下也上調表達，此可能促進烤煙的生長，有利于提高煙草產量和品質且經濟效益較好。而在復種連作處理下調表達，進而可能使得煙草生長變弱、產量降低、品質變差。

烤煙；雙向電泳；蛋白質組學

煙草屬忌連作作物，生產上因單種連作或復種連作都存在連作障礙。李天福等[1]研究表明，種植煙草的間隔時間越短，發病率越高，而且煙草花葉病、煙草黑脛病、根黑腐病、根結線蟲病、青枯病、赤星病、炭疽病、角斑病和低頭黑等的發病率都與連作年限呈不同程度的正相關。由于煙草各種病害發生，造成產量和品質明顯下降[2]，造成巨大的經濟損失。據初步估計，每年全國煙葉10%~15%的損失由各種病害造成的，嚴重時高達70%~90%，甚至絕收[3]。當前，我國因煙草連作，每年直接及間接經濟損失高達40億元[4]，煙草可持續發展已經受到嚴重威脅，嚴重影響煙草的生產和區域經濟的發展。有關煙草連作障礙的研究還處于初步階段，分子機理方面尚未報道，需深入研究。

隨著擬南芥（）、水稻（）和楊樹（）等植物全基因組序列測定的完成和基因組學研究的深入，植物蛋白質組學研究已經成為后基因組時代的熱點之一[5]。近年來，差異蛋白質組學應用于植物或作物科學相關的分子機制研究日益增多，從分子水平較好地解釋了植物/作物自身遺傳表達或對環境響應的分子機理。如在植物生理蛋白質組學、植物突變體蛋白質組學、植物遺傳多樣性蛋白質組學和植物發育蛋白質組學等方面的研究[6-8]。

運用差異蛋白質組學技術來研究烤煙根系蛋白質，在國內外還很少報道。根系作為連接煙草地上部和土壤的“中間橋梁”，同時分泌各種次生代謝物，在煙草品質的形成扮演著非常重要的角色。本研究對復種連作和復種輪作下烤煙根系蛋白質進行提取，進行差異蛋白質組學分析，旨在分子水平上研究烤煙連作障礙的機理，為減輕甚至解決烤煙連作障礙提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2007—2010年在南平浦城縣仙陽烤煙試驗站基地進行，試驗田地勢平坦，土壤質地為砂壤，土壤pH 5.0，有機質34.8 g/kg，速效氮180.0 mg/kg，速效磷21.6 mg/kg，速效鉀103.0 mg/kg，全氮2.38 g/kg，全磷0.73 g/kg，全鉀34.5 g/kg，陽離子交換量7.8 cmol/kg。試驗采取2種種植方式（表1），即（1）復種連作模式：早季種煙，煙收獲后種水稻（烤煙-水稻→烤煙-水稻→烤煙）；（2）復種輪作模式：第1年，早季種煙，煙收獲后種水稻，第2年，早季種水稻，晚季也種水稻（烤煙-水稻→水稻-水稻→烤煙）。試驗采用隨機區組設計，3次重復，共6個小區。每個小區種5畦，每畦植煙44株，共220株，行株距1.2 m×0.5 m。田間管理都按規范化栽培措施進行，從2008年開始實行田間定位試驗，在田間定位第3年即2010年，取樣進行相應實驗。供試烤煙品種為K326。

表1 種植方式

1.2 取樣

2010年烤煙旺長后期時取根系，用水洗凈后甩干，用剪刀剪相同部位根系，每個處理3個重復，有代表性9株煙，每3株根系混勻，作為1個重復，用錫箔紙包住，迅速置于液氮中，之后一并保存到-80 ℃冰箱備用。

1.3 試劑與儀器

丙烯酰胺、N，N-甲叉丙烯酰胺、載體兩性電解質Ampholine（pH 3-10, pH 5-8）、3-[（3-膽酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸（CHAPS）等產品購自國外；聚乙烯吡咯烷酮、三氯乙酸、甘油、磷酸、甲醛等試劑為國藥集團化學試劑公司產品，均為分析純。所有溶液均用Milli-Q超純水配制。

高速冷凍離心機為德國Eppendorf公司產品；真空干燥機出自上海新苗醫療器械制造有限公司；Protean IEF等電聚焦系統、SDS-PAGE垂直電泳均產自美國Bio-Rad公司；凝膠成像系統imagescan為瑞典GE Healthcare公司產品；紫外-可見分光光度計為美國VARIAN公司產品；LC-MS/MS液相質譜為美國Thermo公司產品。

1.4 根系蛋白質樣品的制備

稱取5 g根系，加入少許聚乙烯吡咯烷酮，在液氮冷凍條件下研磨至粉末，采用Mg-NP40法：參照Lee等[9]的方法并有所改進，加入10 mL提取緩沖液（0.5 mol/LTris緩沖液pH 8.3, 2%V/V NP-40，20 mmol/L MgCl2，2%V/V B-巰基乙醇，1 mmol/L苯甲基磺酰氟），置冰上搖床振蕩5~10 min，置冰上超聲30 min。4 ℃，10000 rpm，離心30 min，取上清。加入3倍體積10%三氯乙酸（10%三氯乙酸，0.07%B-巰基乙醇，丙酮），置于-20 ℃冰箱過夜。多洗幾次，期間用80%丙酮（含0.07% B-巰基乙醇）洗1次，直至上清液澄清。最后4 ℃，11 000 rpm，離心25 min，棄上清，低溫真空干燥，制成蛋白質干粉，置于-80 ℃冰箱備用。

1.5 蛋白質的裂解與濃度測定

1.5.1 蛋白質的裂解 Mg-NP40法提取的根系蛋白質干粉與裂解液的比例為1 mg :10 μL。裂解液的配方為：42%尿素 2M Thiourea，65mM DTT，4% CHAPS，0.2%兩性電解質（pH 3.5~10）。

1.5.2 蛋白質濃度的測定 根據Bradford[10]方法，用牛血清白蛋白制作標準曲線，蛋白濃度為0~90 μg/μL，在λ=595 nm時，應用紫外-可見分光光度計測定蛋白質濃度。

1.6 雙向電泳

1.6.1 第一向等電聚焦電泳 參照王經源等[11]的方法，進行自制一向管膠的制備，在25 ℃，按以下程序，200 v 0.5 h，300 v 0.5 h，400 v 0.5 h，500 v 0.5 h，600 v 0.5 h，800 v 16.5 h，1000 v 4 h，1200 v 2 h，進行一向等電聚焦。

1.6.2 膠條平衡 等電聚焦結束后，取出膠條，加入5 mL平衡液（Tris-HCL（pH6.8）4 mL，SDS 2 g，β-巰基乙醇 5 mL，甘油10 mL，稍加溴酚藍，藍色即可），平衡15~30 min。

1.6.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 參照王經源等[11]的方法制備二向膠，電泳程序[12]，設置3個階段：（1）300 v，15 mA，0.5 h；（2）300 v，20 mA，2 h；（3）300 v，25 mA至溴酚藍帶達到膠底部0.6 cm左右，總共約6 h。

1.7 膠體染色與圖像的掃描分析

電泳結束后，采用硝酸銀染色方法染色[13]。膠片使用imagescan掃描，并用軟件ImageMasterTM 2D Platinum 5.0進行圖像分析。

1.8 蛋白質點膠內酶解及肽段提取

1.8.1 脫銀 向取下的蛋白點加60 μL DD.H2O洗2～3次，10 min/次；加60 μL 100%乙腈，用漩渦振蕩器振蕩5 min，重復3次，脫水至膠粒完全變白，超凈臺吹干20~30 min；

1.8.2 膠內消化 加入新鮮配制的10 mM DTT（在990 μL 25 mM NH4HCO3加入10 μL 1M DTT 配制）20 μL溶液，57 ℃孵育1 h；冷卻至室溫，用槍頭吸去殘留液。加入20 μL 55 mM碘乙酰胺（55 μL 1M IAM，945 μL 25 mM NH4HCO3現配）20 μL溶液，置于暗室 60 min。吸棄上清，用100微升的移液器加入60 μL 100 mM NH4HCO3溶液，用漩渦震蕩器震蕩混勻，室溫靜置5 min，如此重復1～3次；用移液器吸棄上清，加入60 μL乙腈，漩渦震蕩器震蕩混勻，室溫靜置5 min，重復1次；吸棄上清，加入60 μL 100 mM NH4HCO3溶液，漩渦震蕩器震蕩混勻，室溫靜置5 min；接著棄上清，加入60 μL乙腈，漩渦震蕩器震蕩混勻，室溫靜置5 min，重復1次，超凈臺吹干30 min。加入15 μL消化液（12.5 ng/μL胰酶（50 mM NH4HCO3配制）溶液），混勻，4 ℃或冰上放置30 min；用移液槍吸出多余的液體，接著加入10 μL 50 mM NH4HCO3溶液，轉速6000 rpm離心30 s，37 ℃消化12 h。

1. 9 質譜分析

1.9.1 上樣 將其冷卻至室溫，轉速6000 rpm離心5 min，用移液槍收集消化液于1.5 mL離心管中；用20 mM碳酸氫銨溶液補至溶液終體積為15~20 μL；將其轉移至上樣管；用于質譜分析。

1.9.2 LC MS/MS分析 LC MS/MS分析是在福建農林大學農業生態研究所進行的。LC條件：高效液相色譜儀：Thermo Scientific Surveyor System；色譜柱：BioBasic C18 Column (100×0.18 mm，particle size: 5 um)；樣品量：10 μL；流動相：A: 0.1% Formic acid in water；B: 0.1% Formic acid in acetonitrile；梯度：5%~35% B in 20 minutes, 35%~95% B in 2 minutes；流速：2.5 μL/min；MS條件：質譜儀：LTQ-XL (Thermo Scientific)；噴霧電壓：3.5 kV；毛細管溫度：275 ℃；鞘氣流速：15 arb；母離子掃描范圍：400~2000 m/z；Isolation width：2 Da。二級質譜條件：AGC Target 1e4, 1 microscans；碰撞能量：35% CID。

1.10 數據庫查詢及蛋白質鑒定

質譜分析所獲得的原始數據用Proteome Discoverer 1.2軟件進行相對定量分析及數據庫的檢索。搜索使用的數據庫為從NCBI下載的蛋白庫。

2 結 果

2.1 不同種植方式烤煙根系差異蛋白質圖譜

蛋白質雙向凝膠電泳圖譜見圖1，在等電點從3.5到10和分子量為14 KD到116 KD的范圍內，通過軟件ImageMaster 5.0的分析，去除假點，每塊膠大概有403個點左右。圖譜清晰，蛋白質點圓而多。

2.2 差異蛋白質點的LC-MS/MS分析與鑒定結果

當對應上兩點之間差異達到2倍以上，認為表達量有明顯差異，在根系樣品中檢測到15差異點，對這15個差異蛋白質點進行LC-MS/MS分析和生物信息學查詢后得到14個蛋白質點的質譜結果，見圖1，11個已知蛋白，3個未知蛋白，見表2。這11個蛋白，復種連作下10個蛋白下調表達，編碼分別是（2、25、35、43、44、48、49、50、52、53）；而只有1個蛋白上調表達，編碼42。

根據各個蛋白的功能將鑒定到的11個蛋白分成以下5大類。

Ⅰ 與植物營養代謝相關蛋白 與植物營養代謝相關蛋白1個，即轉酮醇酶（spot2:transketolase,TK）。

Ⅱ 與能量代謝相關蛋白 與能量代謝相關蛋白1個，為磷酸甘油酸酯激酶（spot50: phosphoglycerate kinase）。

Ⅲ 與植物抗性相關蛋白 與植物抗性相關蛋白有5個，包括線粒體內膜移位酶亞基Tim13（spot25: mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim13），核苷酸結合位點和富亮氨酸重復的胞內受體蛋白（spot44:NBS-LRR(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat)），殺蟲晶體蛋白（spot43:I nsecticidal crystal protein）、單脫氫抗壞血還原酶（spot49: monodehydroascorbate reductase (MDHA)），DnaJ蛋白質（spot52: DnaJ protein）。

Ⅳ 與物質運輸以及信號轉導相關的蛋白 細胞內囊泡運輸蛋白Sly1（spot35: Vesicle trafficking protein Sly1），O-甲基轉移酶（spot48: O-methyltransferase- like protein），鎂依賴性磷酸酶（spot42: Mg-dependent phosphatase）。

Ⅴ核酸代謝相關蛋白 核糖體蛋白質（spot53: Ribosomal protein-like protein）。

3 討 論

轉酮醇酶是在戊糖磷酸循環以及光合成的還原型戊糖磷酸循環中起著重要作用的酶，以焦磷酸硫胺素和Mg2+為輔基。此酶的作用是把磷酸酮糖上的乙酮醇基轉移給磷酸醛糖。Schenk等[14]研究認為，催化2個碳原子單位從磷酸酮糖可逆地轉移到磷酸醛糖上，促進磷酸六碳糖、五碳糖、四碳糖和三碳糖之間的可逆轉換。轉酮醇酶活性的微小下降即可導致植物生長速度下降、芳香族氨基酸和苯丙氨酸代謝產物的抑制[15]。芳香族氨基酸是烤煙香氣的主要物質[16]，苯丙氨酸代謝途徑是影響烤煙香味的主要次生代謝途徑。本研究結果表明，復種輪作烤煙根系TK上調表達，可能有助于提高煙葉的香氣，進而有助于品質提高，而復種連作下調表達，可能對品質的提高有影響。

磷酸甘油酸酯激酶是糖酵解途徑中一個重要的酶，可催化1，3-二磷酸甘油轉變為3-磷酸甘油酸，同時產生1個分子的ATP[17]。本研究結果表明，烤煙輪作與連作相比，烤煙根系磷酸甘油酸酯激酶上調表達，為烤煙根系生命活動提供能量，一定程度上說明，復種連作烤煙根系活力低，可能不利于根系對養分的吸收，烤煙生長較弱。

圖1 不同種植方式下烤煙根系蛋白圖譜

表 2 不同種植方式烤煙根系差異蛋白LC MS/MS質譜分析結果

注：豐度變化為軟件根據蛋白質點的相對體積生成的數值。

抗壞血酸在生物體中具有重要的代謝功能和抗氧化的作用，抗壞血酸與植物的抗逆性呈正相關性[18]。在植物體內，抗壞血酸在抗壞血酸過氧化物酶的作用下，氧化生成單脫氫抗壞血酸。單脫氫抗壞血酸不穩定，在單脫氫抗壞血酸還原酶的作用下可重新轉變成抗壞血酸[19]。因此，單脫氫抗壞血酸還原酶對于抗壞血酸的再生具有重要作用。而且抗壞血酸具有增強多酚類化合物穩定性的作用，多酚是烤煙中的一類重要物質，在烤煙的顏色、香氣、吸味等形成以及煙氣安全性方面都有重要影響；多酚本身不但具有弱的清香，而且在燃吸時產生的熱解成分對煙氣香味的形成有直接影響，可賦予煙氣烤香和清甜香[20]。核苷酸結合位點和富亮氨酸重復的胞內受體蛋白，這是植物抗病基因中數量最多的一類[21]。熱激蛋白具有分子伴侶功能，主要參與生物體內新生肽的運輸、折疊、組裝、定位以及變性蛋白的復性和降解，在細胞生命活動中起著重要的作用[22]。DnaJ蛋白作為輔助蛋白通過激活熱激蛋白的ATP酶活性而調控其活性[23]。本研究發現，復種輪作下這幾個蛋白均上調表達，可能有助于增強烤煙的抗性和提高煙葉的香氣，而復種連作下調表達，可能導致烤煙抗性弱，品質較差。

O-甲基轉移酶催化甲基化反應，通常以S-腺苷-甲硫氨酸作為甲基的供體。O-甲基轉移酶參與苯丙烷代謝途徑，植物體內許多重要的次生性代謝物的合成多與甲基轉移酶有關，如木質素和育兒酚都是甲基化衍生物，植物體內與耐鹽能力有關的重要信號轉導物質——芒柄醇也是在肌醇甲基轉移酶作用下形成的[24]。木質素對維管植物的機械支持、水分運輸和病蟲害防御等具有重要作用[25]。細胞內囊泡運輸蛋白Sly1在細胞內囊泡參與內質網和高爾基體之間的運輸。本研究結果表明，復種輪作下烤煙根系O-甲基轉移酶和細胞內囊泡運輸蛋白Sly1上調表達，加快體內物質運輸，可能有助于烤煙生長和香氣的形成。磷酸酶是許多信號轉導通路控制磷酸化所必需的，是一種能夠將對應底物去磷酸化的酶。鎂依賴性磷酸酶是涉及磷酸化作用重要的酶[26]，而磷酸化目的使蛋白的分子構象發生變化，造成酶活力的缺失或者獲得。本研究發現，復種連作下鎂依賴性磷酸酶上調表達，可能是連作障礙下，刺激了磷酸酶的活性，產生磷酸化作用，造成酶活力的缺失，但磷酸化或去磷酸化并不一定對應著酶的激活或抑制，而且一些酶有多個磷酸化位點參與激活或抑制的調控。這個有待后續實驗進一步深入的研究。

核糖體蛋白質與核糖體RNA共同組成了核糖體，是合成蛋白質的細胞器。除參與蛋白質合成，核糖體蛋白質還具有廣泛的核糖體外功能，如獨立于核糖體外發揮調控基因轉錄、mRNA翻譯、細胞的增殖、分化和凋亡等[27]。在本研究結果表明，輪作烤煙根系核糖體蛋白質上調表達，蛋白質合成增加，也許有利于烤煙的生長，而復種連作烤煙根系蛋白質合成少，同時調控基因轉錄以及細胞生長發育能力降低，可能不利于烤煙的生長。

4 結 論

復種輪作模式（烤煙-水稻→水稻-水稻→烤煙），鑒定到轉酮醇酶、磷酸甘油酸酯激酶、單脫氫抗壞血酸還原酶、核苷酸結合位點和富亮氨酸重復的胞內受體蛋白、DnaJ蛋白、O-甲基轉移酶、細胞內囊泡運輸蛋白Sly1、核糖體蛋白質等蛋白，涉及烤煙香氣的形成、營養代謝、能量轉化、信號轉導、物質運輸、蛋白質代謝等多種途徑，這些酶在復種輪作模式下均上調表達，由此可以表明復種輪作模式可能為烤煙的生長提供了良好而又相對穩定的環境，促進根系生長，進而促進煙草生長，可能有助于提高煙草的產量和品質，提高經濟效益。而這些酶在復種連作模式（烤煙-水稻→烤煙-水稻→烤煙）均下調表達，可能影響烤煙生長，使得烤煙生長較弱，品質較差，經濟效益較低。綜上所述，復種輪作模式（烤煙-水稻→水稻-水稻→烤煙）有助于消減烤煙的連作障礙。

[1] 李天福，王彪，王樹會，等. 云南烤煙輪作的現狀分析與保障措施[J]. 中國煙草科學，2006，27（2）：48-51.

[2] 王茂勝，陳懿，薛小平，等. 長期連作對烤煙產量和質量的影響[J]. 耕作與栽培，2010（1）：8-9，43.

[3] 中國農業科學院煙草研究所. 近年煙草病蟲害發生趨勢及今后防治建議[C]//全國特色優質煙葉開發工作座談會交流材料，2008.

[4] 張繼光，申國明，張久權，等. 煙草連作障礙研究進展[J]. 中國煙草科學，2011，32（3）：95-99.

[5] 喻娟娟，戴紹軍. 植物蛋白質組學研究若干重要進展[J].植物學報，2009，44（4）：410-425.

[6] Xu C P, Xu Y, Huang B R. Protein extraction for two-dimensional gel electrophoresis of proteomic profiling in turfgrass[J]. Crop Sci, 2008, 48: 1608-1614.

[7] 甘露，李殿榮，臧新，等. 甘藍型油菜蛋白質雙向電泳體系的建立[J]. 作物學報，2010，36（4）：612?619.

[8] 皇甫海燕，官春云，郭寶順，等. 蛋白質組學及植物蛋白質組學研究進展[J]. 作物研究，2006（5）：577-581.

[9] Lee D G, Ahsan N, Lee S H, et al. An approach to identify cold-induced low-abundant proteins in rice leaf[J]. CR Biol, 2007, 330(3): 215-225.

[10] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem, 1976, 72: 248-254.

[11] 王經源，陳舒奕，梁義元，等. ISO-DALT雙向電泳方法的優化與改進[J]. 福建農林大學學報，2006，35（2）：187-190.

[12] 吳林坤，王海斌，尤垂淮，等. 地黃塊根總蛋白質提取及雙向電泳條件優化[J]. 中國中藥雜志，2011，36（8）：984-987.

[13] Blum H, Beiers H, Gross H J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels[J]. Electrophoresis, 1987, 8(2): 93-99.

[14] Schenk G, Layfield R, Candy J M, et a1. Molecular evolutionary analysis of the thiamine-diphosphate- dependent enzyme,transketolase[J]. Journal of Molecular Evolution, 1997, 44: 552-572.

[15] 靳靜晨，馬東媛，靳永勝，等. 煙草轉酮醇酶基因(NtTK)的克隆與表達[J]. 河南農業大學學報，2008，42（5）：479-482.

[16] 王霞，楊鐵釗，殷全玉，等. 影響煙草香味的主要次生代謝途徑及其研究進展[J]. 中國煙草科學，2008，29（1）：47-50.

[17] Wu K, Aoki C, El st e A, et al. The synthesis of ATP by glycolytic enzymes in the postsynaptic density and the effect of endogenously generated nitric oxide [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94(24): 13273-13278.

[18] Conklin P L. Recent advances in the role and biosynthesis of ascorbic acid in plants[J]. Plant Cell and Environment. 2001, 24: 383-394.

[19] Smirnoff N, Wheeler G L. Ascorbic acid in plants: biosynthesis and function[J]. Critical review in Bio-chemistry and Molecular Biology, 2000, 35: 291-314.

[20] 宋怡，夏建軍，丁中濤. 抗壞血酸對煙草中多酚類物質穩定性影響的研究[J]. 云南化工，2008，35（6）：12-14.

[21] 王友紅，張鵬飛，陳建群. 植物抗病基因及其作用機理[J]. 植物學通報，2005，22（1）：92-99.

[22] Szabo A, Korszun R, Hartl F U, et a1. A zinc finger-like domain of the molecular chaperone DnaJ is involved in binding to denatured protein substrates[J]. EMBOJ, 1996, 15(2): 408-417.

[23] 崔潤麗，智慧，王永芳，等. 谷子DnaJ蛋白基因的克隆[J]. 華北農學報，2007，22（4）：9-13.

[24] 田鈴，嵇保中，劉曙雯，等. 甲基轉移酶的功能與分類[J]. 生命的化學，2007，27（5）：425-427.

[25] 陶霞娟，趙艷玲，陳雪梅，等. 煙草木質素合成途徑幾個中間代謝物HPLC分析[J]. 北京林業大學學報，2005，27（5）：111-114.

[26] Carline Vanden Abeele, Jackie R Vandenheede，Wilfried Merlevede. The ATP, Mg-dependent Protein Phosphatase[J]. BIOLOGICAL CHEMISTRY, 1987, 262(29): 14086-14089.

[27] 田媛，張俊平. 核糖體蛋白質的新功能及其與相關疾病的關系[J]. 生命的化學，2011，31（4）：488-491.

Analysis of Root Differential Expression Proteins ofunder Two Planting Systems

YOU Chuihuai1,2, CHEN Dongmei1,2, HUANG Jinwen1, TANG Lina3, XU Zhibing1,2, ZHANG Zhongyi1,2, LIN Wenxiong1,2*

(1. Agro-ecological Institute, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Institute of Tobacco, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 3. Tobacco Agricultural Science Research Institute of Fujian Province, Fuzhou 350003, China)

Root differential proteomics was employed in this study to explore the impact of different planting patterns (multiple cropping rotation (MR) and consecutive monoculture multiple cropping (MC) modes) on growth of flue-cured tobacco (L). The results showed that a total of 15 protein spots had significant expression difference; 14 protein spots were identified by LC-MS/MS analysis and database searching. Among which, the function of 11 proteins were identified, three proteins were related to the aroma formation, i.e. transketolase, monodehydroascorbate reductase(MDHA), O-methyltransferase-like protein were up-regulated under MR, it was helpful probably to enhance the tobacco quality. While under the MC treatment, they were down-regulated, and the tobacco quality could be worse. Phosphoglycerate kinase, mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim13, NBS-LRR(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat), DnaJ protein, Vesicle trafficking protein Sly1, Ribosomal protein-like protein were involved in energy metabolism, plant antioxidation reaction, translocation of solute, metabolism of nucleic acid, respectively. They were very important for the growth development of tobacco and all up-regulated under MR treatments, probably increasing the yield and improving the quality of tobacco, and gaining better economic benefit. They were all down-regulated under MC, which may cause weak growth, low yield and poor quality of tobacco.

flue-cured tobacco; two-dimensional electrophoresis; differential proteomic

TS413

1007-5119（2014）01-0089-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.017

福建省煙草公司項目“福建煙區以煙為主耕作制度研究”{閩煙合同[2006]18號}，“福建清香型煙葉適宜區生態基礎研究”（閩煙合同[ 2010]-036）

尤垂淮，男，博士研究生，研究方向為煙草生理生態和栽培技術。E-mail：you123chui@163.com。

通信作者，E-mail：wenxiong181@163.com

2013-01-05

2013-10-10