濁點萃取-比值導數光度法同時測定水中孔雀石綠和結晶紫

李秋，李貴榮，劉長鶴，韓倩

(南華大學公共衛生學院，湖南衡陽 421001)

孔雀石綠(MG)和結晶紫(CV)同屬于堿性三苯甲烷類染料，具有類似結構，在水產養殖、保鮮和運輸過程中，作為殺菌劑和抗寄生蟲藥，用于魚類水霉病、爛鰓病、寄生蟲的防治及原生動物感染等［1-2］。由于孔雀石綠和結晶紫對人畜具有潛在的致畸、致癌和致突變作用［3-4］，20世紀90年代以來世界各國陸續將其列為水產養殖的禁用藥物。但由于孔雀石綠和結晶紫價格低廉，而且抗菌效果較好，在水產養殖中仍被部分養殖戶使用，現已成為影響食品安全的熱點問題。

目前，國內外檢測孔雀石綠和結晶紫及其殘留的方法主要有:液相色譜-線性離子阱質譜法［5］、分子印跡固相萃取高效液相色譜法［6］、超高效液相色譜-串聯質譜法［7］。上述方法所需儀器昂貴，操作條件嚴格，樣品處理復雜，應用受到限制。

本文將濁點萃取和比值導數兩種技術相結合，建立一種新的濁點萃取-比值導數光度法，用于不經分離同時測定水樣中孔雀石綠和結晶紫。方法無需昂貴儀器，操作方便，樣品處理簡單，易于普及應用，測定結果的準確度和靈敏度滿意。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

孔雀石綠、結晶紫、鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀等試劑均為分析純;TritonX-114純度為100%;實驗用水均為超純水。

UV-2550紫外-可見分光光度計;PB-21酸度計;AB204-S電子分析天平;SHHW.21-電熱恒溫三用水箱;TD5K-Ⅲ低速離心機。

1.2 比值導數光度法原理

若a和b二組分混合溶液，在某波長區吸光度具有加和性，即:

對式(2)求微分，得導數比值光譜。

式(4)可作為組分a定量分析依據。同理，可推導b組分的定量分析依據。

1.3 實驗方法

1.3.1 濁點萃取 在10 mL的離心管中依次加入pH 2.8鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液1.5 mL，一定量孔雀石綠(或結晶紫)標準工作液，濃度5%的TritonX-114溶液1.2 mL，用蒸餾水定容至10 mL刻度線，搖勻，放入50℃恒溫水浴箱中15 min，溶液變渾濁，取出。以4 000 r/min離心5 min，上層水相棄去。加入無水乙醇，溶解底層孔雀石綠(或結晶紫)富集相并稀釋到0.5 mL。

1.3.2 比值導數光譜 將上述溶液轉入微型吸收池中，用紫外-可見分光光度計測定400～700 nm波長范圍吸收光譜，并應用數據處理軟件處理，得到比值吸收光譜和導數比值吸收光譜。選擇639，476 nm波長分別為孔雀石綠和結晶紫的測定波長，以該兩波長處的導數比值光譜吸收值分別對孔雀石綠和結晶紫濃度繪制標準曲線，采用標準曲線法測定樣品中孔雀石綠和結晶紫的含量。

2 結果與討論

2.1 吸收光譜

圖1是在表面活性劑富集相中孔雀石綠和/或結晶紫的吸收光譜圖。

圖1 吸收光譜Fig.1 The absorption spectra

由圖1可知，孔雀石綠吸收峰位于624 nm處 ，結晶紫吸收峰位于593 nm處，二者的吸收光譜存在嚴重的相互重疊。應用比值導數法可以消除兩者之間的干擾，則可在兩者物質共存的情況下，對兩者直接進行測定。

2.2 比值吸收光譜和比值導數光譜及測量波長的選擇

按照比值導數光譜的原理，以濃度為8.0×10－6mol/L CV溶液的吸收光譜為除數因子，對二者混合溶液的吸收光譜進行比值-微分處理(以消除共存結晶紫的干擾)，得到孔雀石綠的比值光譜和比值一階導數光譜，見圖2。

圖2 孔雀石綠的比值光譜(a)和比值一階導數光譜(b)Fig.2 The ratio spectra(a)and first derivative ratio spectra(b)of MG(1～8MG:0.1～10×10－6mol/L)

由圖2可知，該比值導數光譜中440，639 nm波長處的導數值均與孔雀石綠的濃度成比例。根據加標回收率等相關指標，選擇639 nm作為孔雀石綠的測量波長。

以濃度為6.0×10－6mol/L MG溶液的吸收光譜為除數因子，求得結晶紫的比值光譜和一階比值導數光譜，見圖3。同理，根據圖3可選擇476 nm作為結晶紫的測量波長。

圖3 結晶紫的比值光譜(a)和比值一階導數光譜(b)Fig.3 The ratio spectra(a)and first derivative ratio spectra(b)of CV(1～8CV:0.1～10×10－6mol/L)

2.3 實驗條件的優化

2.3.1 緩沖溶液及pH值的選擇 實驗了檸檬酸鈉-鹽酸、檸檬酸鈉-檸檬酸、鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸、磷酸氫二鈉-檸檬酸、甘氨酸-鹽酸、B-R緩沖液對萃取效率的影響。結果表明，鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸溶液的萃取效率最高。因此，選擇了鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸作為該體系的緩沖液。pH值對體系萃取效率的影響，見圖4。

圖4 pH值對體系(孔雀石綠和結晶紫)吸收值的影響Fig.4 The effect of pH value of the system(MG+CV)

由圖4可知，當pH＜2.8時，隨著pH值增大，孔雀石綠和結晶紫的吸收值增大，當pH＞2.8后，吸收值反而減小。因此，選擇pH為2.8。

鄰苯二甲酸氫鉀-鹽酸緩沖溶液pH為2.8，考察緩沖溶液用量對濁點萃取效率的影響，結果見圖5。

圖5 緩沖液用量對MG和CV混合物體系吸光度的影響Fig.5 The effect of buffer solutions volumes on the system(MG+CV)

由圖5可知，緩沖溶液用量在1.5 mL時，吸光度值較高。所以，選擇緩沖溶液用量為1.5 mL。

2.3.2 表面活性劑及用量的選擇 采用TritonX-114、TritonX-100和吐溫-80三種表面活性劑，結果表明，TritonX-114的萃取效率最高。如圖6顯示，對孔雀石綠和結晶紫的混合溶液萃取后測定，TritonX-114的用量為1.2 mL時，吸收值達到了最大值。說明萃取率最好，故選擇TritonX-114的用量為1.2 mL。

圖6 TritonX-114用量對孔雀石綠和結晶紫混合溶液吸光度的影響Fig.6 The effect of TritonX-114 solutions volumes on the system(MG+CV)

2.3.3 萃取溫度和平衡時間的選擇 考察了水浴溫度30～75℃ 和平衡時間5～40 min對體系吸光度的影響。實驗表明，水浴溫度為50℃ 時，吸光度達到最大值，說明萃取效率最好。隨著萃取平衡時間的增長，富膠束相萃取率越高吸光度越大，15 min即可萃取完全。故本萃取實驗選擇溫度為50℃，水浴中加熱15 min。

2.4 方法的檢出限和線性范圍

2.4.1 除數因子的選擇 實驗選擇了不同濃度的孔雀石綠或結晶紫標準溶液作為除數因子，比較所繪制的標準曲線的線性范圍、斜率和相關系數，并選擇最佳的結果，以提高測定的準確度和靈敏度。實驗結果表明，選用濃度為8.0×10－6mol/L的MG和6.0×10－6mol/L的CV作為除數因子時，分析方法的相關指標較好。

2.4.2 方法的檢出限和線性范圍 在優化的條件下，取不同量的孔雀石綠和/或結晶紫標準溶液，按照實驗方法的步驟，求得回歸方程分別為:

實驗結果表明，孔雀石綠和結晶紫在1.0×10－8～1.0×10－6mol/L范圍內呈良好的線性關系，檢出限分別為 3.93 ×10－9，4.96 ×10－9mol/L。在線性范圍內，配制高中低3組濃度的標準溶液進行精密度實驗(n=6)，孔雀石綠的相對標準偏差分別為 4.08%，3.89%，1.22%，結晶紫的相對標準偏差分別為 4.31%，3.85%，3.39%。

由于濁點萃取前總體積為10 mL，預富集后總體積為0.5 mL，所以富集倍率為20倍。

2.5 共存離子的干擾實驗

以孔雀石綠和結晶紫的混合溶液(MG和CV濃度均為4.0×10－7mol/L)進行干擾實驗，考察了常見離子及有機物對測定的影響。當相對誤差控制小于±5% 時(以倍計)，實驗結果見表1。

表1 常見離子及有機物的干擾實驗結果Table 1 Interfere with test result of common ions and organics

2.6 樣品的處理和測定

池塘水經離心分離后，取上清液，在最佳條件下測定，重復5次，結果見表2。

表2 水樣測定結果(n=5)Table 2 The determination results of water samples

由表2可知，孔雀石綠和結晶紫在樣品中加標回收率分別為 96.6% ～104.0% 和 98.5% ～110.0%。

3 結論

本實驗結合濁點萃取和比值導數兩種技術，建立了一種濁點萃取-比值導數分光光度新方法，實現了不經分離同時檢測環境水樣中的孔雀石綠和結晶紫含量的一種。該方法簡單、安全、無污染、靈敏度高，用于測定實際樣品，結果令人滿意。

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