冷凍干燥過程中重要參數塌陷溫度的研究

楊智，李代禧，張燕，郭柏松，楊春生，趙鳳

(1.上海交通大學藥學院，上海 201108;2.上海東富龍科技股份有限公司，上海 201108)

冷凍干燥是目前廣泛應用的生物制品保存方法［1］，但是凍干過程干燥速率低、時間長、能耗大等不足，導致生產成本較高，因此優化和改進凍干過程是當前面臨的重要問題［2］。冷凍干燥過程可分為預凍、一次干燥、二次干燥［3］。其中一次干燥是整個冷凍干燥過程中周期最長的階段，一次干燥周期又與其升華時的溫度相關。如果能盡量提高一次升華時的樣品溫度，就可以很大程度上縮短升華干燥時間。樣品溫度每升高1℃，干燥時間縮短13%［2，4］。但生物制品溫度過高，會引起塌陷或者熔融，進而導致干燥層的多孔結構喪失、殘余水分增多、復水時間延長，嚴重的將會導致生物制品活性喪失。因此，冷凍干燥中尋找一次升華時的臨界溫度尤為重要。

目前絕大多數都是以共熔溫度作為一次升華時的臨界溫度，很少關于玻璃化轉變溫度Tg，塌陷溫度Tc的數據更是甚少提到［5-6］。關于制品的塌陷溫度和相應的玻璃化轉變溫度/共熔溫度之間的相互關系幾乎沒有被研究過。

本文利用凍干顯微鏡和差示掃描量熱儀研究氯化鈉鹽溶液、蔗糖水溶液、海藻糖水溶液和甘露醇水溶液的塌陷溫度和玻璃化轉變溫度，分析研究兩者之間的關系。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

純化水，自制;果糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、氯化鈉均為分析純;液氮(純度＞99.999%);氮氣(純度＞99.99%)。

LYOSTAT2凍干顯微鏡;差示掃描量熱儀(DSC);純水儀(明澈TM-D 24UV純水系統 );XS205電子天平;水系針筒式濾膜過濾器，自制。

1.2 溶液制備

按質量濃度配制供試品溶液，以配制2%蔗糖為例。用電子天平精密稱取蔗糖0.200 0 g，加純化水至10.000 0 g溶解，用 0.22 μL濾膜過濾待用。其他供試品溶液依此法配制。

1.3 實驗方法

1.3.1 崩解溫度測定 采用凍干顯微鏡(配有液氮冷卻系統、可編程溫度控制器和真空泵)測量。顯微鏡放大倍數為100倍。載玻片上放置一銀環，取2 μL樣品溶液于銀環和光源中間，壓力保持在1 Pa。溫度標定采用氯化鎂、氯化鈉和氯化鉀(共晶熔融溫度分別為 －33.6，－21.1，－10.7 ℃)。樣品以10℃/min從25℃降溫至－55℃，等溫5 min，抽真空，然后以2℃/min升溫。本文中的塌陷溫度Tc為樣品在干燥界面和冷凍界面交界處出現亮點時的溫度。每個實驗重復3次，取平均值。

1.3.2 DSC檢測 吹掃氣體采用50 mL/min左右速率的氮氣(純度＞99.99%，氮氣在高至600℃的溫度范圍內都是惰性的，因此是DSC測量的標準氣體)。溫度標定采用銦和鋅(熔融溫度分別為156.6℃和419.47℃)。樣品皿采用鋁坩堝，蓋鉆孔，用壓片機壓制。樣品質量濃度分別為2%，5%，8%。在參比側放置與樣品皿相同的空皿。樣品均以10℃/min從25℃降溫至－55℃，等溫5 min，然后以2℃/min升溫至20℃。在升溫掃描時讀取數據，玻璃化轉變溫度Tg，取中點溫度。每個實驗重復3次，取平均值。

2 結果與討論

2.1 崩解溫度

顯微鏡凍干實驗表明，對于降溫時發生玻璃化轉變的樣品，如果糖、蔗糖和海藻糖，其水溶液升溫時均發生塌陷，臨界溫度為塌陷溫度。塌陷溫度可分為微塌陷溫度和塌陷溫度。前者表示的是樣品結構的局部喪失，干燥界面與升華界面交界處出現小的孔洞或裂縫;后者對應樣品結構的整體喪失，干燥界面與升華界面交界處出現大的孔洞或裂縫，干燥界面與升華界面已不再相連。本實驗定義的塌陷溫度為微塌陷溫度。降溫速率為10℃/min，升溫速率為2℃/min條件下，各物質在不同濃度時的塌陷溫度、共晶熔融溫度和玻璃化轉變溫度見表1。

表1 二元水溶液的塌陷溫度(Tc)、共晶熔融溫度(Tem)和玻璃化轉變溫度(T'g)Table 1 Collapse temperature(Tc)，eutectic melting temperature(Tem)and glass transition temperature(T'g)of aqueous solutions

由表1可知，果糖、蔗糖和海藻糖的塌陷溫度和玻璃化轉變溫度均隨樣品質量分數的增大而增大，這與文獻［7-9］結論一致。

降溫速率對物質的塌陷溫度的影響見表2。

表2 不同質量濃度蔗糖溶液在不同降溫速率下的塌陷溫度Table 2 Collapse temperature of sucrose under different cooling rate

由表2可知，3種溶液濃度的塌陷溫度均隨降溫速率的增大而減少。因為在凍干過程中，降溫速率過快，會導致結晶不充分，生成的冰晶顆粒較大，升華時傳質阻力變大，升華速率降低，塌陷溫度就會減小。

實驗還發現，甘露醇在升溫過程中未發生崩解，該物質熱穩定性較好，作為保護劑，可以很好地提高凍干樣品的塌陷溫度，從而提高樣品預凍溫度，大大縮短干燥時間，降低成本。

圖1是甘露醇水溶液的顯微圖像。

從圖中可以直觀看出，在整個干燥過程中，溶液都未發生崩解，直至全部升華。

圖1 2%甘露醇溶液的凍干顯微圖像Fig.1 Microscopic observations of freeze-drying of 2%mannitol aqueous solution

圖2為2%海藻糖水溶液的凍干顯微圖像。

圖2 2%海藻糖溶液的凍干顯微圖像Fig.2 Microscopic observations of freeze-drying of 2%trehalose aqueous solution

由圖2可知，在－26.9℃時，干燥界面和凍結界面結構都比較完好，沒有發生任何塌陷;當樣品溫度升高到－26.6℃時開始發生塌陷，干燥界面與凍結界面交界處局部出現了小的孔洞，孔洞不相連，但隨著溫度的升高，孔洞會逐漸變大，并連成一片，直至整體塌陷。此時升華界面移動速度明顯降低，表明干燥層的粘性流動堵塞了水蒸氣逸出通道。

2.2 塌陷溫度與相應的玻璃化轉變溫度分析

由表1可知:①蔗糖和海藻糖的塌陷溫度都比其相應的玻璃化轉變溫度略高些，差值在5℃左右。因此，以玻璃化轉變溫度作為臨界溫度有些保守，而應以塌陷溫度作為臨界溫度。另外，塌陷溫度和玻璃化轉變溫度/共晶熔融溫度的實驗環境不同，塌陷溫度是利用FDM在真正的冷凍干燥過程中測得的;而玻璃化轉變溫度/共晶熔融溫度是利用DSC在封閉環境下測得的，所以，對于晶體或是非晶體，塌陷溫度作為一次升華溫度都更能真實地反映產品特性;②無論是玻璃化轉變溫度還是塌陷溫度，都隨著樣品分子量的增大而呈增長趨勢。因此選用凍干保護劑時，在保證產品品質的情況下，應優先選用大分子保護劑，以提高升華干燥溫度，縮短干燥時間，降低生產成本。

在DSC實驗中發現，甘露醇在升溫過程中－25℃時出現一個放熱峰，且明顯低于在降溫過程中生成的結晶放熱峰。

圖3 甘露醇的DSC曲線圖Fig.3 DSC curve of mannitol

經分析該峰為冷結晶峰。冷結晶是由于物質內部該結晶的部分，因為溫度與時間的限制，無法完全結晶，當溫度高于T'g后，這些未完成結晶的部分由于分子鏈柔軟而具有足夠的運動能力，重新排列成為新生結晶的現象［10-11］。冷結晶過程中分子鏈排列從無序到有序，是一個熵減的過程，會放出熱量，在DSC掃描曲線上呈現放熱峰，溫度值小于熔融溫度。

對于降溫時發生共晶的樣品，如氯化鈉，其水溶液升溫到共晶熔融溫度時，凍結層和干燥層整體發生融化。

圖4為氯化鈉水溶液的凍干顯微圖像。

由圖4可知，氯化鈉溶液在－20.4℃時，干燥界面和冷凍界面結構都完整;而達到塌陷溫度－20.2℃，整體發生了融化。

圖4 5%氯化鈉水溶液的凍干顯微圖像Fig.4 Microscopic observations of freeze-drying of 5%NaCl

3 結論

(1)測定了氯化鈉、蔗糖、海藻糖和甘露醇等水溶液的玻璃化轉變溫度和塌陷溫度。玻璃化轉變溫度和熔融溫度是在封閉環境下測得的，塌陷溫度是在真正的冷凍干燥過程中測得的，所以塌陷溫度更能真實地反應產品的特性，對冷凍干燥具有重要的指導意義。

(2)蔗糖和海藻糖的水溶液在降溫時發生玻璃化轉變，塌陷溫度和玻璃化轉變溫度比較接近，但并不相等;而氯化鈉和甘露醇二元水溶液降溫時發生結晶，塌陷溫度與熔融溫度也不相等，其中甘露醇在升華過程中未發生崩解。

(3)塌陷溫度一般都比相應的玻璃化轉變溫度高5℃左右。因此，降溫過程中，樣品不論是發生玻璃化轉變還是結晶，均以塌陷溫度作為臨界溫度，可在保證產品品質的前提下，提高升華干燥速率，縮短凍干時間。

(4)樣品的質量分數、降溫速率以及分子量的大小都會對塌陷溫度產生影響。質量分數越大，降溫速率越小，則塌陷溫度越高。對于不同的物質，分子量大的物質，則塌陷溫度大。

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