HPLC法同時(shí)測(cè)定水解前后杜仲葉黃酮苷元的含量

王志宏，周云雷，彭勝，鄭陽(yáng)，史麗娟，彭密軍

(吉首大學(xué)林產(chǎn)化工工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室杜仲湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南張家界 427000)

杜仲是我國(guó)特有的名貴滋補(bǔ)藥材，具有“三降六抗一增”的功效，引起了人們的廣泛關(guān)注［1］。杜仲含有的活性成分包括黃酮類(lèi)、苯丙素類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)和木脂素等，其中黃酮類(lèi)物質(zhì)一直是人們研究的熱點(diǎn)，包括其檢測(cè)方法、提取工藝以及分離純化等方面［2］。成軍等對(duì)杜仲葉提取物進(jìn)行分離純化，經(jīng)波譜法鑒定 5 種化合物為:槲皮素(3，5，7，3'，4'-五羥基黃酮)、山奈酚(3，5，7，4'-四羥基黃酮)、紫云英苷(山奈酚-O-β-D-葡萄糖苷)、異槲皮苷(槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷)、蘆丁(槲皮素-3-O-蕓香糖苷)［3］。付桂明采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)發(fā)現(xiàn)杜仲黃酮還包括金絲桃苷(槲皮素-3-半乳糖苷)、槲皮素-3-O-葡萄糖基-(1→2)-阿拉伯糖苷或槲皮素-3-O-木糖基-(1→2)-葡萄糖苷等［4］。研究表明，杜仲中黃酮類(lèi)物質(zhì)的苷元以槲皮素和山奈酚為主。近年研究發(fā)現(xiàn)，黃酮苷元在人體內(nèi)吸收速度、吸收含量及活性功效方面比黃酮糖苷有明顯的優(yōu)勢(shì)［5-7］，其效價(jià)高于黃酮糖苷［8］。通過(guò)酸水解可將糖苷鍵原子質(zhì)子化，使糖苷鍵斷裂，成為苷元。

本文建立快速測(cè)定杜仲黃酮苷元的檢測(cè)方法，并對(duì)酸水解前后杜仲黃酮苷元的含量進(jìn)行探討，以期為杜仲黃酮深度開(kāi)發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

槲皮素(批號(hào) YA0806YB13)、山奈酚(批號(hào)20130329)，均由上海源葉生物科技有限公司提供，純度≥98%(HPLC);甲醇，色譜純;杜仲葉(采集于吉首大學(xué)張家界校區(qū)實(shí)驗(yàn)基地，經(jīng)吉首大學(xué)廖博儒研究員鑒定為杜仲，60℃烘干，粉碎，過(guò)80目篩);杜仲素(杜仲葉提取物，總黃酮含量＞20%)，由張家界恒興生物科技有限公司生產(chǎn)。

LC-20A高效液相色譜儀;U-3900紫外分光光度計(jì);BM400型數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋;AEG-220型萬(wàn)分之一天平;GZX-9146-MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 色譜條件

液相色譜柱Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.2% 磷酸(63 ∶37)，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)370 nm，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

分別精密稱(chēng)取槲皮素和山奈酚對(duì)照品于25 mL棕色容量瓶，用無(wú)水甲醇溶解并定容，制成0.1 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備液(4℃貯藏)。取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋?zhuān)渲葡盗袧舛鹊幕旌蠘?biāo)準(zhǔn)液，槲皮素0.5，1.0，10，20，40，60，80 μg/mL，山奈酚 0.5，1.0，4.0，8.0，12，16，18 μg/mL(4 ℃貯藏)。

1.4 供試溶液的制備

1.4.1 水解前樣品溶液制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取杜仲葉樣品0.5 g于50 mL 燒瓶，以料液比1∶30(g/mL)，溫度70℃，回流提取3次，合并濾液，定容至50 mL。準(zhǔn)確稱(chēng)取杜仲素20 mg于試管中，加入5 mL無(wú)水甲醇，超聲輔助溶解，過(guò)濾，定容至10 mL。樣品溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)行測(cè)定。

1.4.2 水解樣品溶液制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取杜仲葉樣品0.5 g于 50 mL三角瓶中，以料液比為 1∶100(g/mL)無(wú)水甲醇-鹽酸(4∶1)混合溶液，70℃水解4 h，過(guò)濾，定容至 50 mL。適當(dāng)稀釋?zhuān)?jīng) 0.45 μm 濾膜過(guò)濾，進(jìn)行測(cè)定。準(zhǔn)確稱(chēng)取杜仲素樣品20 mg于試管，按上述條件進(jìn)行水解，過(guò)濾、定容至10 mL，稀釋?zhuān)?jīng) 0.45 μm 濾膜，進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的優(yōu)化 槲皮素和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外光譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液紫外最大吸收峰Fig.1 The UV absorption peak of standard solution

由圖1可知，槲皮素和山奈酚在254 nm和370 nm處都有吸收峰，但是370 nm處的吸收峰強(qiáng)度更大，峰值較高。所以確定檢測(cè)波長(zhǎng)為370 nm。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇及優(yōu)化 根據(jù)文獻(xiàn)及《中國(guó)藥典》報(bào)道，同時(shí)測(cè)定槲皮素和山奈酚的流動(dòng)相(有機(jī)相∶水相)比例為50∶50。但在測(cè)定過(guò)程中，該條件下槲皮素和山奈酚的保留時(shí)間在40 min左右，保留時(shí)間較晚，峰形拖尾。通過(guò)考察流動(dòng)相比例，確定有機(jī)相∶水相為63∶37時(shí)，保留時(shí)間在10 min左右，峰形良好，且與其它物質(zhì)之間的分離效果較好。

由于所測(cè)苷元顯弱酸性，加入少量的酸可以適當(dāng)改善拖尾現(xiàn)象，有文獻(xiàn)報(bào)道使用0.4%的磷酸。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)磷酸濃度為0.2%時(shí)，峰形即可達(dá)到同樣的效果，同時(shí)考慮實(shí)驗(yàn)的簡(jiǎn)便性及色譜柱耐受pH范圍，所以選擇磷酸濃度為0.2%。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系 對(duì)1.3節(jié)配制的系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，見(jiàn)表1。

表1 槲皮素、山奈酚的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍(n=3)Table 1 The regression equation，correlation coefficient of references and liner ranges

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一濃度的混合對(duì)照品，按照1.2節(jié)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，分別記錄槲皮素和山奈酚的峰面積。槲皮素和山奈酚的峰面積的RSD分別為1.65%和0.85%。表明儀器的測(cè)定精密度較好。

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品，在0，2，4，10，16，24 h 分別進(jìn)樣，分別記錄槲皮素和山奈酚的峰面積。槲皮素和山奈酚的峰面積的RSD分別為1.73%和0.57%。表明供測(cè)樣品在24 h之內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批杜仲葉樣品，每份約為0.5 g左右，按1.4.2節(jié)方法處理，平行 6份，進(jìn)樣20 μL，分別記錄槲皮素和山奈酚的峰面積。槲皮素和山奈酚的峰面積的RSD分別為0.74%和2.00%。表明該方法測(cè)定杜仲葉樣品的重復(fù)性較好。

2.2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的杜仲葉供試品9份(槲皮素含量約為2.5 mg/mL，山奈酚含量約為 0.4 mg/mL)，每份約 0.5 g 左右，精確稱(chēng)量，按照1.4.2節(jié)方法進(jìn)行水解處理，過(guò)濾，定容至50 mL。取0.5 mL，再定容至10 mL。分別配制對(duì)照品含量為樣品中含量約為80%，100%和120%的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，將樣品的溶液與對(duì)應(yīng)不同濃度的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液按1∶1混合，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 杜仲黃酮苷元加標(biāo)回收率(n=9)Table 2 The recoveries of flavonoid aglycones from Eucommia ulmoides Oliv.

2.3 杜仲及杜仲素黃酮苷元含量的測(cè)定

趙德義等通過(guò)比較杜仲黃酮和銀杏黃酮的HPLC指紋圖譜發(fā)現(xiàn)［9］，二者極為相近，并且都含有槲皮素和山奈酚。2010版《中國(guó)藥典》已對(duì)銀杏黃酮的水解方法有較為詳細(xì)的說(shuō)明［10］，本文參照《中國(guó)藥典》和相關(guān)文獻(xiàn)［11-13］，對(duì)杜仲葉和杜仲素進(jìn)行水解，并比較水解前后苷元含量的變化。高效液相色譜測(cè)定黃酮苷元混合溶液對(duì)照品以及水解前后黃酮苷元的結(jié)果見(jiàn)圖3，其中1為槲皮素，2為山奈酚。

圖2 對(duì)照品與杜仲樣品的HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatograms of reference substance and samples of Eucommia ulmoides Oliv.

杜仲葉和杜仲素按照同樣的水解工藝進(jìn)行水解，經(jīng)高效液相色譜測(cè)定，水解前后杜仲葉以及杜仲素黃酮苷元含量見(jiàn)表3。

由表3可知，杜仲葉本身含有槲皮素與山奈酚，且測(cè)定結(jié)果與張欣等測(cè)定的結(jié)果基本一致［14］;水解之后的杜仲葉中槲皮素含量提升有20倍之多，山奈酚含量也提升將近16倍，杜仲素在水解之前槲皮素含量就能達(dá)到0.2%，山奈酚可達(dá)到0.04%，水解之后，苷元含量提高將近7倍，水解效果明顯;實(shí)驗(yàn)中按照上述條件，對(duì)含量為98%的蘆丁進(jìn)行水解，通過(guò)3次平行實(shí)驗(yàn)，水解得率可達(dá)85.68%，證明該方法可水解純度較高的蘆丁，且得率可觀。

3 結(jié)論

建立快速且簡(jiǎn)便測(cè)定杜仲黃酮苷元的HPLC方法，并對(duì)杜仲葉及杜仲素中水解前后黃酮苷元進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，杜仲葉中槲皮素含量為0.021%，而山奈酚則僅含0.005%;通過(guò)酸水解，可將苷鍵原子質(zhì)子化，使苷鍵斷裂，杜仲黃酮糖苷變?yōu)檐赵远胖偃~黃酮苷元含量提高20倍，杜仲素則提高約7倍。

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